Caracterización y control de la resistencia a antimicrobianos y de los biofilms en bacterias patógenas de interés en la Industria Alimentaria: hacia el enfoque Una Salud

Abstract

[ES] La resistencia a los antibióticos es un problema mundial de primera magnitud e importancia creciente, que afecta a la salud humana, la sanidad animal y el medioambiente. En investigaciones previas se ha observado que la exposición a dosis bajas de algunos compuestos ampliamente usados en la Industria Alimentaria como aditivos, descontaminantes o desinfectantes, puede reducir la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos. Es esencial determinar qué biocidas pueden contribuir a la emergencia de resistencia a los antibióticos, así como conocer las concentraciones mínimas inhibitorias (MICs) y las concentraciones mínimas bactericidas (MBCs) de dichos compuestos.

La inmensa mayoría de las células microbianas se encuentran formando parte de biopelículas o biofilms. Estas estructuras, que se pueden formar en diversas superficies de las industrias alimentarias, son una fuente importante de contaminación de los alimentos con microorganismos patógenos y alterantes y, dada su elevada resistencia a los desinfectantes, favorecen la persistencia microbiana en los entornos de procesado de alimentos. Por ello, es necesario mejorar el conocimiento sobre la arquitectura y viabilidad de los biofilms en diferentes condiciones, así como identificar nuevos compuestos o materiales que permitan su control.

Esta Tesis Doctoral se encuadra en el enfoque “Una Salud” y ha tenido como objetivo general contribuir a la caracterización y el control de la resistencia a antimicrobianos y de los biofilms en bacterias zoonósicas transmitidas por alimentos. Los 10 objetivos principales y las conclusiones de la Tesis Doctoral, que se ha estructurado en 13 capítulos, se indican a continuación.

En primer lugar, se pretendió ampliar el conocimiento sobre la susceptibilidad de Listeria monocytogenes a diferentes biocidas y antibióticos mediante el estudio de las MICs y de las MBCs. Se observó una elevada prevalencia de resistencia a antibióticos en las cepas estudiadas, hecho que pone de manifiesto la importancia de adoptar medidas encaminadas a controlar la resistencia de este microorganismo a los antimicrobianos, especialmente teniendo en cuenta la necesidad de tratamiento con antibióticos en los casos de listeriosis invasiva. Las correlaciones positivas encontradas entre las MICs y las MBCs de biocidas y antibióticos con distintos modos de acción apuntan a la presencia de mecanismos de resistencia cruzada o de co-resistencia.

El segundo objetivo fue determinar si la exposición a dosis bajas de biocidas puede modificar la susceptibilidad a los antibióticos o a otros biocidas en cepas de L. monocytogenes, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y Enterococcus faecium resistente a la vancomicina (VRE). Se puso de manifiesto que el contacto con concentraciones subinhibitorias de algunos aditivos, descontaminantes o desinfectantes provoca una reducción de la susceptibilidad de las bacterias a los compuestos, la adaptación cruzada a otros biocidas y un aumento de su resistencia a los antibióticos, a la vez que modifica la hidrofobicidad de la superficie celular (aspecto que se encuentra relacionado con la capacidad de las bacterias para formar biofilm). Por ello, debería evitarse el uso de concentraciones subinhibitorias de biocidas en los entornos de procesado de alimentos.

En tercer lugar, se ha valorado la utilidad de la técnica de citometría de flujo para determinar si la adaptación previa a determinados biocidas modifica el porcentaje de células de L. monocytogenes supervivientes a distintos tratamientos con tetraciclina. Se ha comprobado que la citometría de flujo es una técnica útil, rápida y sencilla para estudiar la resistencia a los antibióticos de las bacterias sometidas a diferentes condiciones. Mediante este método se ha observado que el contacto de L. monocytogenes con dosis bajas de cloruro de benzalconio y, especialmente, de ácido peracético, incrementa la resistencia de las células bacterianas a la tetraciclina, lo que supone un hallazgo preocupante, ya que se trata de un antibiótico frecuentemente utilizado para el tratamiento de la listeriosis humana.

El cuarto objetivo fue conocer la prevalencia, los niveles y los patrones de resistencia a antibióticos de L. monocytogenes en carne de pollo en el noroeste de la Península Ibérica (España y Portugal). Se detectaron células de L. monocytogenes en algún estado fisiológico (viables cultivables, viables no cultivables o inactivadas) en el 85% de las muestras analizadas. El método clásico de detección de L. monocytogenes en alimentos (UNE-EN ISO 11290-1:2018) tiene la limitación de que no permite detectar las células viables no cultivables. Por otro lado, la q-PCR, técnica para la que se ha encontrado un límite de detección de 2,15 log10 ufc/g, no es útil cuando la bacteria está presente en bajas concentraciones. Estas circunstancias ponen de manifiesto la conveniencia de combinar ambas técnicas (dependiente e independiente de cultivo) para mejorar la detección de L. monocytogenes en alimentos. Todas las cepas presentaron resistencia a varios antibióticos (entre 3 y 7). Estos hallazgos justifican la necesidad de que el manipulador de carne de ave adopte unas correctas prácticas higiénicas, evitando el insuficiente cocinado y la contaminación cruzada, con objeto de reducir así el riesgo de listeriosis para el consumidor.

Por otra parte, se determinó el efecto de diferentes aditivos sobre la prevalencia y los patrones de resistencia a antibióticos de L. monocytogenes en carne de pollo picada. De los tres aditivos alimentarios añadidos a la carne, nitrito sódico, nisina y ácido láctico, únicamente el último redujo los niveles microbianos en las condiciones de aplicación. Por otro lado, los tres compuestos provocaron un aumento de los niveles de resistencia a antibióticos en las cepas de L. monocytogenes presentes de forma natural en la carne.

El sexto objetivo se centró en determinar la arquitectura y la viabilidad de las biopelículas formadas por varias especies bacterianas sobre distintas superficies de contacto a diferentes tiempos y temperaturas de incubación. El análisis de los parámetros estructurales y de las reconstrucciones tridimensionales de los biofilms de S. enterica, L. monocytogenes, MRSA y VRE, estudiados por microscopía láser confocal de barrido (CLSM), indica que estos microorganismos forman biopelículas compactas sobre poliestireno y vidrio en 24 horas, hecho que pone de manifiesto la necesidad de realizar la desinfección de las superficies y equipos inmediatamente tras su uso con el objeto de prevenir la formación de biofilms por estas bacterias patógenas. En el caso de Listeria spp., se observó que el material de contacto juega un papel importante en la formación de biopelículas. De los diferentes materiales ensayados, los biofilms alcanzaron su mayor biovolumen en resina, seguida de poliestireno. En vidrio, y sobre todo en grafeno, las biopelículas producidas presentan el menor biovolumen, por lo que los recubrimientos de monocapa de grafeno pueden ser de utilidad práctica para reducir la formación de biofilms por esta bacteria.

El séptimo objetivo fue conocer la distribución espacial y el biovolumen de las bacterias en biofilms monoespecie y mixtos (formados por bacterias Gram-positivas y Gram-negativas), a lo largo de 10 días de incubación a 10 °C. Se ha comprobado que el biovolumen y la distribución de las bacterias en los biofilms depende de la presencia de otros grupos microbianos. Los biofilms mixtos presentan un modelo espacial de doble capa, con las bacterias Gram-positivas (L. monocytogenes, MRSA o VRE) en el fondo del biofilm y las células de S. enterica situadas la capa superior. Este patrón de distribución en dos capas debería tenerse en cuenta a la hora de desarrollar procedimientos efectivos de desinfección.

El octavo objetivo consistió en determinar, mediante microscopía láser confocal de barrido (CLSM), el efecto de concentraciones bajas de hipoclorito de sodio y cloruro de benzalconio sobre los biofilms de L. monocytogenes. A concentraciones de 1,5MIC, el cloruro de benzalconio reduce marcadamente la biomasa, pero no la viabilidad, de las biopelículas de L. monocytogenes. Estos resultados sugieren que podría producirse el desprendimiento de células vivas de las biopelículas tratadas con concentraciones bajas de este desinfectante, lo que implicaría la posible diseminación de bacterias vivas a partir del biofilm, con el consiguiente riesgo para la Salud Pública.

El noveno objetivo ha sido determinar, mediante microscopía láser confocal de barrido (CLSM), el efecto de varias concentraciones de hipoclorito de sodio y cloruro de benzalconio sobre la capacidad de L. monocytogenes para formar biofilms. Las concentraciones subinhibitorias de cloruro de benzalconio pueden favorecer el desarrollo de biopelículas en cepas de L. monocytogenes resistentes a este compuesto, en diferente medida según los mecanismos de resistencia involucrados. Se trata de un hallazgo destacable, teniendo en cuenta que la formación de biopelículas juega un papel importante en la persistencia de este microorganismo en las instalaciones de procesado de alimentos. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de aplicar concentraciones de biocidas adecuadas con el objeto de prevenir la formación de biopelículas por L. monocytogenes.

El décimo y último objetivo se centró en conocer el efecto de diferentes concentraciones del bacteriófago P100 sobre las biopelículas de L. monocytogenes. Se ha demostrado la potencial utilidad de este fago como una alternativa eficaz para el control y erradicación de los biofilms formados por L. monocytogenes, con óptimos resultados a concentraciones iguales o superiores a 8 log10 ufp/ml.

Como conclusión general, señalar que los resultados de esta Tesis Doctoral permiten una mejor comprensión de los fenómenos de resistencia a los antibióticos, tolerancia a los biocidas y capacidad para formar biofilm en bacterias zoonósicas sometidas a diferentes condiciones. Este conocimiento puede ser de utilidad para optimizar las estrategias encaminadas al control de estos desafíos para la Salud Pública tanto en la Industria Alimentaria como en el Sistema Sanitario.