Modelos de infección "in vitro" para el análisis de la respuesta inmunológica frente a micobacterias

Abstract

[ES] M. tuberculosis es la especie del género Mycobacterium sp que más infecciones causa en todo el mundo. Sin embargo, en las últimas décadas ha aumentado considerablemente la prevalencia de infecciones por micobacterias no tuberculosas (MNT), fundamentalmente la forma pulmonar asociada a patologías crónicas, como bronquiectasias. Todavía se desconocen todos los mecanismos inmunológicos implicados en estas infecciones, en parte por la diversidad de ensayos in vitro disponibles, que no logran reproducir adecuadamente la respuesta fisiológica. En el presente trabajo, optimizamos diversos modelos derivados de células sanguíneas para analizar la actividad anti-micobacteriana frente a diferentes especies del género, seleccionadas en función de su nivel de patogenicidad, para reproducir los fenómenos sucedidos in vivo en poblaciones susceptibles, como fumadores o pacientes con bronquiectasias.

La purificación celular se realizó, generalmente, por doble gradiente de sedimentación y la individualización bacteriana, por sonicación. En la infección in vitro se empleó un bajo número de bacterias por célula, que se incubaron en medio sin suero. Para poder asegurar que los aislados clínicos correspondían a cepas diferentes, diseñamos un método sencillo de genotipado, basado en la técnica “Amplified Fragment Length Polymorphism” (AFLP, en inglés), que nos permitió obtener resultados fácilmente interpretables, con buen nivel de discriminación.

En el modelo de macrófagos derivados de monocitos no se observó actividad micobactericida. Sin embargo, con los modelos de leucocitos totales y sangre completa, que comprenden todas las fracciones celulares inmunitarias y el componente humoral, obtuvimos diferentes patrones de resistencia en función de la patogenicidad de las cepas infectantes. En estos modelos se comprobó la restricción de crecimiento en todas las especies empleando EDTA como anticoagulante, relacionada con su actividad bacteriostática. También se emplearon para valorar la respuesta inmunitaria de la población fumadora frente a M. tuberculosis, sin observar diferencias con el grupo control (no fumadores), en los distintos modelos celulares empleados (neutrófilos, células mononucleares de sangre periférica o monocitos).

Para reproducir aspectos de la respuesta inmunológica en las bronquiectasias empleamos un modelo de neutrófilos con diferentes cepas de M. abscessus y de M. mageritense procedentes de aislados clínicos. No observamos actividad micobactericida contra ninguna especie, pero sí una limitación del crecimiento y agregación de M. abscessus al emplear altas concentraciones celulares, que se potenciaba al añadir, en el tiempo, neutrófilos frescos, antes de que se iniciara la multiplicación bacteriana. Si la agregación llegaba a producirse, comprobamos que se incrementaba la liberación de enzimas proteolíticas, relacionadas con el daño tisular en esta patología. Si bien los sobrenadantes de células infectadas con M. mageritense aumentaron la quimiotaxis de los neutrófilos, este efecto no se observó empleando M. abscessus.

[EN] M. tuberculosis is the species of the genus Mycobacterium sp that causes most infections worldwide. However, in recent decades, the prevalence of nontuberculous mycobacterial (NTM) infections has increased considerably, mainly the pulmonary form associated with chronic pathologies, such as bronchiectasis. Many immunological mechanisms involved in these infections are still unknown, partly due to the diversity of available in vitro assays, which fail to adequately reproduce the physiological response. In the present work, we optimized several blood cell derived models to analyze the anti-mycobacterial activity against different species of the genus, selected based on their level of pathogenicity, in order to reproduce the phenomena occurring in vivo in susceptible populations, such as smokers or patients with bronchiectasis.

Cell purification was, generally, performed by double gradient sedimentation and bacterial individualization by sonication. In vitro infection used a low number of bacteria per cell, which were incubated in serum-free medium. In order to ensure that clinical isolates corresponded to different strains, we designed a simple genotyping method based on the Amplified Fragment Length Polymorohism (AFLP) technique, which allowed us to obtain easily interpretable results with a good level of discrimination.

No mycobactericidal activity was observed in the monocyte-derived macrophage model. However, with the total leukocyte and whole blood models, with all the immune cell fractions and humoral components, we obtained different resistance patterns depending on the pathogenicity of the infecting strains. In these models, growth restriction was observed in all species using EDTA as anticoagulant, related to their bacteriostatic activity. These models were also used to evaluate the immune response of the smoking population against M. tuberculosis, without observing differences with the control group (non-smokers) in the different cellular models analyzed (neutrophils, peripheral blood mononuclear cells or monocytes).

To reproduce aspects of the immune response in bronchiectasis, we used a neutrophil model with different clinical isolates of M. abscessus and M. mageritense. We did not observe mycobactericidal activity against any species, but did observe a limitation of M. abscessus growth and aggregation when high cellular concentrations were used, which was enhanced by the addition of fresh neutrophils over time, before bacterial multiplication occurred. When mycobacteria aggregated, the release of proteolytic enzymes, related to tissue damage in this pathology, was increased. While supernatants from cells infected with M. mageritense increased neutrophil chemotaxis, this effect was not observed using M. abscessus.