Potencial terapéutico y toxicidad de inhibidores de topoisomerasas como antiparasitarios = Structural characterization of the dna topoisomerase from "Leishmania donovani"

Abstract

Los protozoos parásitos del género Leishmania, son responsables de las enfermedades conocidas con el nombre genérico de leishmaniosis. La quimimioterapia disponible frente a estas enfermedades tiene eficacia limitada, es cara, presenta múltiples efectos secundarios, requiere tratamientos prolongados y con frecuencia favorece la aparición de cepas resistentes. Las ADN topoisomerasas (Top) son enzimas encargadas de resolver problemas topológicos originados en los procesos de replicación, transcripción y recombinación del ADN. Se han descrito tres tipos de Top en función de sus propiedades catalíticas, gasto energético y estructura proteica: Top tipo I (TopI), Top tipo II (Top II) y Top tipo III (Top III). Las TopI se subdividen además en TopIA y TopIB. La TopIB de Leishmania es una proteína heterodimérica, particularidad que sólo comparte con las enzimas de tripanosomas y que la convierte en una potencial diana terapéutica. En la presente memoria evaluamos el potencial terapéutico de una serie de inhibidores de la TopIB en tres especies de Leishmania: L. major, L. infantum y L. donovani. Los compuestos seleccionados para el estudio fueron: camptotecina (CPT), topotecán (TPT), SN38, irinotecán (profármaco del SN38) y dos indenoisoquinolinas denominadas: AM1355 y MNR 2-50. Para ello se realizaron ensayos dosis-respuesta, utilizando estos compuestos en promastigotes de las tres especies de Leishmania, así como en dos tipos de células de mamífero: RAW 264,7 y macrófagos peritoneales murinos. En todos los casos utilizamos como control dos fármacos leishmanicidas empleados regularmente en clínica: miltefosina y paromomicina. Calculando las IC50 de cada compuesto en todas las células mencionadas y los índices terapéuticos (IT) correspondientes, pudimos observar que CPT, TPT y SN38 se comportaron como buenos leishmanicidas aunque con unos ITs muy bajos, no así en el caso de AM1355 y MNR 2-50 que mostraron buenos IT. La actuación como potenciales fármacos quedaría pues restringida a las dos indenoisoquinolinas. Por otro lado, caracterizamos la enzima TopIB de L. donovani (LdTopIB) y estudiamos su comportamiento frente a los inhibidores seleccionados. Para ello, tras su clonaje en un vector biscistrónico, el gen que codifica para LdTopIB se expresó en una cepa de S. cerevisae auxótorofa en su propia TopIB y se purificó mediante cromatografía en columna. Los ensayos de inhibición realizados demuestran que CPT, TPT, SN38, AM1355 y MNR 2-50 inhiben la LdTopIB a concentraciones inferiores a las que se produce la inhibición de la enzima humana sin embargo, el tiempo de estabilización de los complejos enzima-ADN formados en el proceso es muy pequeño. La formación de complejos enzima-ADN estabilizados por los inhibidores también se estudió complementariamente in vivo y de todos ellos la CPT fue el compuesto con el que se observó el mayor porcentaje de formación de estos complejos. Nuestro laboratorio ha generado dos cepas transgénicas, una de L. infantum portadora de forma estable del gen que codifica para la proteína fluorescente mCherry y otra de L. major portadora del gen que codifica para la proteína también fluorescente citrina. Como alternativa a los métodos clásicos de evaluación de la citotoxicidad (azul alamar, rojo neutro o MTT), estas cepas se han utilizado para evaluar la citotoxicidad de los distintos inhibidores empleados en el presente trabajo. Debido a los buenos IT obtenidos con las indenoisoquinolinas AM1355 y MNR 2-50, su potencial terapéutico se probó en infecciones experimentales in vivo. Los resultados mostraron una reducción de la carga parasitaria en hígado y bazo de los animales tratados con MNR 2-50 y una reducción de la carga parasitaria en el bazo de los tratados con AM1355