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dc.contributorEscuela de Ingeniería Agraria y Forestales_ES
dc.contributor.advisorCasquero Luelmo, Pedro Antonio 
dc.contributor.advisorGutiérrez Martín, Santiago 
dc.contributor.advisorMayo Prieto, Sara
dc.contributor.authorÁlvarez García, Samuel
dc.contributor.otherIngenieria Agroforestales_ES
dc.date2021-11-29
dc.date.accessioned2021-12-20T18:23:10Z
dc.date.available2021-12-20T18:23:10Z
dc.date.submitted2021-07-19
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10612/13752
dc.description243 p.es_ES
dc.description.abstractNTRODUCCIÓN 1. Agricultura sostenible frente a los retos presentes y futuros La población mundial no deja de crecer y con ella la demanda de alimentos y otros productos agrícolas (Dhankher y Foyer, 2018). La erradicación del hambre es uno de los ejes centrales de los “Objetivos de Desarrollo Sostenible” que plantea la ONU para 2030. A pesar de ello, este problema aún no ha sido solucionado y existen una serie de riesgos para su consecución derivados del cambio climático, problemas energéticos y otros factores socioeconómicos y ambientales para la producción agrícola. Entre dichos factores, los estreses bióticos y abióticos a los que los cultivos se ven sometidos representan un elemento importante. Las enfermedades y plagas agrícolas causan grandes daños y pérdidas tanto a cultivos industriales como alimentarios (Pandey et al., 2017). Además, estos agentes biológicos también afectan a los productos tras la recolección, pudiendo suponer la pérdida de hasta el 30% de los mismos (Dukare et al., 2019). En este sentido, tradicionalmente se han venido utilizando productos fitosanitarios de síntesis química. Sin embargo, debido a los efectos perniciosos que estos productos presentan en muchos casos hacia el medio ambiente y la salud humana, está comenzando a prohibirse la utilización de muchos de ellos (Alengebawy et al., 2021). De este modo, es necesario la búsqueda de alternativas para la protección de cultivos y productos agrícolas que sean más respetuosas con el medio ambiente y supongan un menor riesgo para la salud humana. Entre las estrategias más importantes a este respecto destacan los Agentes de Control Biológico como una estrategia fiable, efectiva y más segura (Kashyap et al., 2017). 2. La judía común (Phaseolus vulgaris L.) Las leguminosas son cultivos de extraordinaria importancia para la nutrición humana y la alimentación de animales (De Ron, 2015). Pertenecen a la familia vegetal Fabaceae. Se trata de productos con alto contenido proteínico y una amplia distribución, lo que hace de ellos un cultivo clave, sobre todo en aquellos países en vías de desarrollo donde el acceso a la proteína animal no está generalizado (Sanon et al., 1998). Además, las leguminosas son capaces de fijar nitrógeno atmosférico inorgánico, de modo que su cultivo enriquece el suelo en este elemento esencial para el desarrollo de las plantas. Es por esto que las leguminosas son clave en las estrategias de rotación de cultivos y en una agricultura sostenible (Casquero et al., 2006). Por otro lado, la judía común (Phaseolus vulgaris L.) ocupa el tercer puesto entre las leguminosas más importantes de las dedicadas al consumo humano, ya que su cultivo se extiende por todos los continentes y es fuente de proteínas, vitaminas y minerales. La Comunidad Autónoma de Castilla y León es la más importante productora de judía en España y en ella destaca la provincia de León, donde se encuentra la Indicación Geográfica Protegida (IGP) “Alubia de La Bañeza-León”. Esta provincia supuso más del 45% de la superficie cultivada de toda España y más del 57% de la producción nacional en 2019 (MAPA, 2021). La alubia se ve afectada por diversas enfermedades y plagas. Entre ellas, los hongos filamentosos fitopatógenos representan un grupo con especial relevancia. En muchos casos, microorganismos de los géneros Rhizoctonia, Pythium, Fusarium, Thielaviopsis, Sclerotinia, y Aphanomyces atacan juntos formando un complejo patogénico. En muchos cultivos Rhizoctonia solani Kühn, junto con el amarilleamiento producido por Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli J.B Kendr. & W.C. Snyder y la podredumbre radicular causada por Fusarium solani f. sp. phaseoli (Burkh) W.C. Snyder & H.N. Hansen son las principales enfermedades fúngicas. En los últimos años la alubia en la IGP “Alubia de la Bañeza-León” se ha visto afectado por estas micosis, asociadas prácticamente a la totalidad de las plantas afectadas por podredumbre radicular en estas comarcas (Valenciano et al., 2006). En lo referente a R. solani, la infección de la planta se produce a través de heridas o por un recubrimiento de un órgano por el micelio, el cual penetra hasta la epidermis. La producción de enzimas líticas es muy importante en este proceso. Una vez infecta el hongo se ramifica rápidamente alcanzando las células de los tejidos próximos. Es un patógeno más agresivo en condiciones adversas para la planta, con temperaturas entre 15 y 18 ºC y con el suelo húmedo (Agrios, 2002). La enfermedad produce lesiones en los cotiledones, en el hipocotilo y en las raíces. El efecto más característico de este hongo es el conocido como caída o “damping-off” de las plántulas jóvenes. El hongo puede permanecer entre campañas agrícolas en el campo en forma de esclerocios o micelio, colonizando restos vegetales, plantas perennes o el suelo (Hall, 1992). En el caso de F. oxysporum f. sp. phaseoli, se trata de un hongo filamentosos asexual que causa traqueomicosis en la judía común, conocido como amarilleamiento o marchitez de la judía. La sintomatología más características es la clorosis seguida de un amarilleamiento, que comienza en las hojas más bajas y va subiendo por la planta a medida que avanza la infección. Los haces vasculares muestran tonos marrones y rojizos, incluso antes de presentarse los síntomas externos (Singh and Schwartz, 2011). La infección comienza generalmente bajo el suelo y cuando llega a los vasos del xilema se desplaza por ellos para invadir el resto de la planta. Las pérdidas que produce son generalmente más importantes cuando la infección se da en las etapas tempranas de desarrollo de las plantas (Agrios, 2002). Por otro lado, Acanthoscelides obtectus (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchidae) en un insecto coleóptero que actúa como plaga primaria en granos almacenados, entre ellos de forma importante en la alubia (Berger et al., 2017; Rodríguez-González et al., 2019). Este insecto evolucionó en Mesoamérica y se ha distribuido por todo el mundo, produciendo grandes pérdidas en leguminosas. El insecto puede colonizar las semillas en campo o directamente hacerlo en el almacén, donde produce la mayor parte del daño (Baier y Webster, 1992). Las hembras pones los huevos y las larvas perforan un orificio por el que penetran en la semilla. Se desarrollan en el interior alimentándose de las mismas hasta que emergen como nuevos adultos. Este proceso reduce la calidad y el valor comercial del producto, e incluso puede condicionar su futura germinación (Paul et al., 2009). Además, el daño generado favorece la aparición de plagas secundarias y enfermedades postcosecha (Dukare et al., 2019). 3. Control Biológico El control biológico, o biocontrol, puede ser definido como el uso de organismos biológicos, sus partes, o sustancias que producen para controlar el daño causado por otros organismos biológicos. Como ya se ha indicado, se trata de una estrategia que se viene desarrollando mucho en las últimas décadas con motivo de la búsqueda de alternativas ecológicas y saludables al uso de productos fitosanitarios de síntesis química. Entre los agentes de control biológico empleados los microorganismos presentan un papel central en agricultura (Pirttilä et al., 2021; Sare et al., 2021). Estos organismos presentan un conjunto de características ventajosas. Cuando se aplican de forma correcta suelen ser más respetuosos con el medio ambiente, y sus metabolitos son menos tóxicos y persistentes que numerosos productos de síntesis química (Tilocca et al., 2020). Muchos de ellos pueden ser producidos de forma sencilla y barata (Paul et al., 2009). En muchas ocasiones presentan efectos beneficiosos aditivos, controlando enfermedades y a la vez mejorando el desarrollo y crecimiento de las plantas (Maurya, 2020). Son menos agresivos contra otros organismos beneficiosos para el cultivo y su diversidad de mecanismos dificulta el desarrollo de resistencias por parte de os fitopatógenos. Existen cuatro mecanismos generales por los cuales los agentes de control biológico pueden mejorar la sanidad y rendimiento de los cultivos: Competición: dado que el espacio y os recursos son limitados en la naturaleza, la competencia por los mismo puede servir como limitante para el desarrollo de plagas y enfermedades. Esta competición permite controlar e incluso expulsar a los organismos dañinos de las zonas desde donde podrían afectar a las plantas (Alfiky y Weisskopf, 2021). Además, este proceso se puede dar incluso en la superficie o el interior de los propios órganos vegetales (Carro-Huerga et al., 2020; Poveda et al., 2020). Parasitismo: mediante este mecanismo un agente de control biológico parasita al organismo fitopatógeno, alimentándose de él y pudiendo llegar a causarle la muerte. La producción de enzimas líticas y la capacidad de remodelar la propia pared celular son claves en este proceso en lo que a los hongos filamentosos se refiere (Sood et al., 2020). Los microorganismos pueden presentar actividad parasítica frente a hongos, insectos y nemátodos (John et al., 2010; Jaber and Ownley, 2018; Poveda et al., 2020). Inducción del crecimiento y las defensas de la planta: los agentes de control biológico pueden presentar diversos mecanismos que fomentan el desarrollo más vigoroso y la productividad de los cultivos, tanto desde el exterior como desde el interior de las plantas. En este proceso tiene relevancia la movilización de nutrientes en el suelo, así como la producción de metabolitos secundarios microbianos y de hormonas vegetales (Vinale et al., 2008). Antibiosis: consiste en la producción de enzimas y metabolitos secundarios con actividad tóxica contra otros organismos. Estos compuestos pueden ser de naturaleza volátil o no volátil, e conllevan complejas interacciones, afectando a un amplio rango de seres vivos (Dukare et al., 2019). Debido al papel central que juegan en esta tesis, los compuestos orgánicos volátiles biogénicos (COVBs), así como las técnicas empleadas en su estudio, se tratarán a continuación en mayor profundidad: Los COVBs son pequeñas moléculas de bajo peso molecular que en condiciones ambientales se presentan en forma gaseosa. Estos compuestos actúan como mediadores en diversas interacciones biológicas como competición (Hammerbacher et al., 2019), simbiosis (Werner et al., 2016; Kandasamy et al., 2019), reconocimiento (Li et al., 2018) o comunicación (Markovic et al., 2019). También se ha propuesto que son importantes en el establecimiento de comunidades ecológicas (Li et al., 2020). Entre los productores de COVBs destacan los microorganismos, tanto bacterias, como hongos filamentosos y levaduras. Los estudios sobre interacciones entre microorganismos mediadas por COBVs han demostrado que ejercen diversos efectos, que no dependen solo de las cepas intervinientes sino también de las condiciones ambientales (Lo Cantore et al., 2015; Speckbacher et al., 2020). Químicamente pueden ser muy diversos, por ejemplo, alcoholes, cetonas, alquenos, furanos, sesquiterpenos, ésteres, derivados bencénicos, etc. Los volátiles microbianos también pueden afectar a las plantas de diversos modos. Así, se ha demostrado que pueden modular su fisiología (Sánchez-López et al., 2016), incrementar su resistencia a herbívoros (Cordovez et al., 2017) y patógenos vegetales induciendo respuestas defensivas (Frank et al., 2021). También pueden favorecer la acumulación de compuestos o la nutrición de la planta, la fotosíntesis o la remodelación de la pared celular (Ameztoy et al., 2019; García-Gómez et al., 2019; Lee et al., 2019). Finalmente, los COVBs microbianos también afectan a insectos. Sin embargo, la mayoría de los estudios a este respecto se han centrado en su capacidad atractiva o repelente, atendiendo a cuestiones etológicas (Contreras-Cornejo et al., 2020). Comparativamente, pocos estudios se han realizad para analizar los efectos insecticidas de estos compuestos. En lo referente a la metodología, para el cultivo de microorganismos es de vital importancia la gestión de los flujos gaseosos y sus aplicaciones (Spadaro y Droby, 2016; Alijani et al., 2019). Los ensayos de competencia entre microorganismos se han convertido en herramientas imprescindibles para la caracterización in vitro de cepas con capacidad de control biológico y para la detección de compuestos bioactivos producidos por las mismas. Sin embargo, las metodologías existentes para la investigación de interacciones mediadas por COVBs presentan una serie de limitaciones y problemas relacionadas con falta de espacio, poca flexibilidad, imposibilidad de permitir intercambio de gases, contaminaciones cruzadas, dificultad de manejo, etc. 4. Trichoderma spp. Persoon, Fries Trichoderma un género fúngico bien conocido de amplia distribución que se medra principalmente en ambientes terrestres, mostrando una gran adaptabilidad a diversas condiciones ecológica (Contreras-Cornejo et al., 2020). Se encuentra presente en material orgánica en descomposición, normalmente como un hongo saprófito. Sin embargo, también puede crecer parasitando otros hongos, nematodos e insectos. Algunos Trichoderma también se desarrollan en simbiosis con plantas (Jalali et al., 2017; Macías-Rodríguez et al., 2020). Algunos miembros de este género han sido descritos como un riesgo para el cultivo de hongos (Kredics et al., 2021), o como patógenos oportunistas en humanos inmunodeprimidos (Sautour et al., 2018). Sin embargo, esto son casos aislados y mayoritariamente Trichoderma es considerado un hongo no peligroso y con importantes capacidades de control biológico de plagas y enfermedades agrícolas, así como promotor del crecimiento y los sistemas defensivos de las plantas (Sood et al., 2020). En la actualidad se han descrito unas 375 especies de este género, con aproximadamente 50 nuevas identificadas cada año (Cai y Druzhinina, 2021). Trichoderma pertenece a la División Ascomycota, y su teleomorfo ha sido nombrado tradicionalmente como Hypocrea. No obstante, la tendencia actual es referir ambos teleomorfo y anamorfo con un único nombre genérico, siendo Trichoderma el empleado de forma general (Bissett et al., 2015). Como se ha dicho, este género fúngico presenta interés industrial como productor de enzimas y otros compuestos empleados en diversos procesos de base biotecnológica. Por otro lado, destaca su capacidad para combatir enfermedades y plagas vegetales relacionadas con grandes pérdidas en agricultura, así como su capacidad para inducir el crecimiento y desarrollo de las plantas y mejorar su sanidad general, produciendo importantes incrementos en el rendimiento de los cultivos (Kredics et al., 2021). Trichoderma tiene capacidad de inducir estos efectos mediante diferentes modos de acción. Miembros de este género han demostrado importante capacidad de competencia por recursos y espacio con organismos patógenos de plantas, incluso en el interior de las mismas (Carro-Huerga et al., 2020). Para ello, Trichoderma ha demostrado mayor capacidad de acceder a nutrientes que muchos de los organismos fitopatógenos. Además, la gran velocidad a la que se desarrolla el micelio del hongo permite a este ocupar nichos de modo eficiente (Sarrocco et al., 2009). Adicionalmente, se ha demostrado que esta movilización de nutrientes fomenta el crecimiento de las plantas a la vez que priva de ellos a otros microorganismos, y que los exudados de las plantas a su vez pueden favorecer el establecimiento de Trichoderma en su entorno (Vinale et al., 2013). Como se ha dicho, estos hongos son también capaces de promover el crecimiento de las plantas y sus sistemas defensivos. Para ello, además de la movilización de nutrientes, Trichoderma produce otra serie de compuestos, tanto volátiles como no volátiles, que inducen el desarrollo de las plantas. Del mismo modo, también se ha descrito la producción y emisión de hormonas vegetales con efectos similares (Alfiky and Weisskopf, 2021). La interacción de este hongo con diversas plantas ha demostrado que es capaz de inducir resistencia sistémica adquirida (RSA), resistencia sistémica inducida (RSI) y respuesta de hipersensibilidad (RH) (Harman, 2006). Finalmente, Trichoderma puede enfrentarse a microorganismos patógenos o plagas mediante mecanismos de parasitismo y/o antibiosis. Para ello es capaz de reconocer posibles huéspedes y desarrollarse hacia ellos, infectándoles cuando entra en contacto con ellos (Alfiky and Weisskopf, 2021). Durante este proceso emite enzimas hidrolíticas que degradas las paredes celulares de los organismos atacados (Gomes et al., 2020). Por otro lado, un elemento importante de estas interacciones es la capacidad de Trichoderma de sobreponerse a la toxicidad de sus propios compuestos mediante una intensa actividad de remodelación de su pared celular (Kappel et al., 2020). A este mecanismo se suma la liberación al medio de compuestos volátiles y no volátiles con propiedades tóxicas frente a una gran variedad de organismos (Vinale and Sivasithamparam, 2020).   HIPÓTESIS Y OBJETIVOS La hipótesis general de esta tesis doctoral es que las condiciones de crecimiento in vitro en las cuales se evalúa la actividad biológica de los metabolitos secundarios microbianos determina el resultado final de las interacciones estudiadas, por lo que las metodologías de investigación empleadas para ello deben tener en cuenta estas condiciones y ser capaces de modularlas. Para evaluar dicha hipótesis se plantearon los siguientes objetivos generales: I. Evaluar la actividad auto-inhibitoria de Trichoderma spp. empleando ensayos de membrana in vitro y compararla con la actividad antifúngica producida por estos hongos frente a Fusarium oxysporum en las mismas condiciones. II. Desarrollar un dispositivo sencillo y eficiente para evaluar las interacciones entre diferentes microorganismos, y entre microorganismos e insectos, mediadas por Compuestos Orgánicos Volátiles Biogénicos (COVBs), y probar su correcto funcionamiento empleando para ello aislados de Trichoderma como agentes de control biológico (ACBs). III. Desarrollar un dispositivo sencillo y eficiente para evaluar las interacciones entre plantas y microorganismos mediadas por Compuestos Orgánicos Volátiles Biogénicos (COVBs), y probar su correcto funcionamiento empleando para ello aislados de Trichoderma como agentes de control biológico (ACBs). IV. Identificar COVBs individuales emitidos por Trichoderma spp. que puedan ser los responsables de las actividades biológicas observadas.   METODOLOGÍA 1. Organismos empleados En la presente tesis se ha empleado un aislado del hongo F. oxysporum que demostró actividad patogénica en plantas de judía común (P. vulgaris), al que se denominó F3, y un aislado de R. solani patógeno de judía. Ambos procedentes de campos correspondientes a la IGP “Alubia de La Bañeza-León”. Para los ensayos de autotoxicidad se emplearon 10 aislados del Trichoderma spp., siete de ellos pertenecientes a la especie T. harzianum, y siendo los tres restantes T. citrinoviride, T. velutinum y T. gamsii. Todos ellos procedían de campos de la IGP “Alubia de La Bañeza-León”. En lo referente a los ensayos de interacción mediada por compuestos volátiles empleando los nuevos dispositivos VOC Chamber y p-mVOC Chamber, se emplearon cuatro cepas de T. harzianum. La cepa silvestre T. harzianum CECT 2413 (Colección Española de Cultivos Tipo, Valencia, España), a la que se llamó T34; y tres transformantes derivados de ella. Éstas cepas fueron desarrolladas en trabajos previos dentro de este grupo de investigación (Cardoza et al., 2006; Malmierca et al., 2015a, b). E20 consiste en la cepa silvestre a la que se le ha bloqueado el gen erg1 que codifica la escualen epoxidasa, lo que lleva a la sobreacumulación de escualeno y la reducción de ergosterol. A su vez, T34 y E20 son los parentales a partir de los que se obtuvieron T34-5.27 y E20-5.7 mediante la introducción del gen tri5 de T. arundinaceum, que codifica una terpeno ciclasa. Esta modificación induce la sobreproducción del compuesto volátil trichodieno, que forma parte de la ruta biosintética de los trichotecenos. En los experimentos con plantas se emplearon semillas de trigo (Triticum aestivum var. tremie). Por último, como insecto plaga para evaluar el efecto de los COVBs fúngicos se empleó el gorgojo de la alubia (Acanthoscelides obtectus (Say) Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchidae). Estos insectos fueron capturados en almacenes de semilla pertenecientes a la IGP “Alubia de La Bañeza-León”. 2. Evaluación de la actividad antifúngica de autoinhibitoria de los metabolitos secundarios no volátiles producidos por Trichoderma spp. mediante ensayos de membrana Los ensayos de membrana se desarrollaron con la metodología descrita por Mayo et al., (2015). Para ello se colocó una membrana de celofán estéril sobre pacas Petri con medio Patata Dextrosa Agar (PDA). Sobre cada una de ellas se dispuso un disco de 6 mm de diámetro extraído del borde en crecimiento de colonias de los diferentes aislados de Trichoderma spp. Para los controles se realizó el mismo procedimiento en placas sin cultivar. Los hongos se dejaron crecer por 2 días a 25 ºC para que los metabolitos producidos difundieran hacia el medio. Tras esto, el celofán junto con el micelio fúngico se retiró e inmediatamente después se sembraron discos de 6 mm del borde activo del aislado de F. oxysporum. El diámetro de las colonias se midió a los 3 y 7 días de crecimiento. El procedimiento para la evaluación de la autotoxicidad o autoinhibición fue el mismo, pero colocando de nuevo un disco de la misma cepa de Trichoderma en lugar de F. oxysporum. Las medidas en este caso se realizaron a las 24 y 48 horas debido a la mayor velocidad de crecimiento de este hongo. Se realizaron 5 réplicas por tratamiento. 3. Evaluación del prototipo “VOC Chaber” y de los efectos producidos por COVBs de T. harzianum sobre F. oxysporum y R. solani. Se compararon la técnica rutinaria de placas Petri enfrentadas (DDS) con VOC Chamber ventiladas y no ventiladas. Para ello se llenaron las placas Petri con 18 ml de medio PDA. Discos de 6 mm de las distintas cepas de T. harzianum (T34, E20, T34-5.27 y E20-5.70) fueron sembrados en el centro de las placas y se dejaron crecer durante 48 horas. Tras esto se sembraron en nuevas placas discos de 6 mm de F. oxysporum y R. solani y se procedió al montaje de los diferentes dispositivos. Las cámaras formadas mediante el método DDS y las “VOC Chamber” no ventiladas fueron selladas con parafilm. Los controles se realizaron sustituyendo la placa con T. harzianum por placas no cultivadas con 18 ml de PDA. Tras esto, las cámaras con los hongos se colocaron a 25 ºC. En el caso de R. solani se midió el crecimiento radial de las colonias tras 1, 2, 3 y 4 días; mientras que en el caso de F. oxysporum estas se realizaron tras 3, 5 y 7 días. Se llevaron a cabo 5 réplicas por tratamiento. 4. Evaluación del prototipo “p-mVOC Chaber” y de los efectos producidos por COVBs de T. harzianum sobre plántulas de trigo (Triticum aestivum var. tremie) En primer lugar, las cepas de T. harzianum (T34, E20, T34-5.27 y E20-5.70) se sembraron mediante la técnica ya descrita en el apartado anterior en placas Petri con 18 ml de PDA. Estos hongos se dejaron crecer durante 72 horas a 25 ºC. Pasado este tiempo, 10 semillas de trigo previamente desinfectadas fueron colocadas sobre 4 capas de papel de filtro (73 g m-2) en el interior de recipientes de vidrio de 946 ml. Inmediatamente después se montaron las cámaras colocando en la parte inferior los recipientes con las semillas, sobre cada uno de ellos una pieza central de la “p-mVOC Chamber” con el orificio central cubierto por un Filtro Whatman (47 mm), y sobre cada una de estas, boca abajo, se colocó una placa con hongo tras serle retirada la tapa. Las cámaras montadas se sellaron con parafilm y se colocaron en una cámara de crecimiento (23-23 ºC, fotoperiodo de 16:8 y 3000 lux (41 µmol m-2 s-1) durante 10 días. Se realizaron 5 réplicas por tratamiento y el experimento se repitió 5 veces. La germinación de las semillas se contabilizó a los 3, 7 y 10 días. Tras esto, se procedió a medir el peso fresco y longitud de la raíz y la parte aérea de cinco plantas de cada réplica. Se secaron a 60 ºC hasta que el peso se mantuvo constante, momento en el que se procedió a evaluar el peso seco de las muestras. Otras 3 plantas fueron empleadas para analizar el rendimiento cuántico de fluorescencia de la clorofila usando un fluorímetro PAM. Tras esto se almacenaron a -80 ºC para la futura evaluación del contenido en clorofila, que se llevó a cabo mediante el método de Arnon (Arnon, 1949). 5. Empleo de “VOC Chambers” para la valuación de los efectos producidos por COVBs de T. harzianum sobre A. obtectus y los daños que este produce sobre alubias Para este experimento se emplearon cámaras no ventiladas. En primer lugar, se sembraron discos de 6 mm de las cuatro cepas de T. harzianum en placas Petri con 18 ml de PDA. Los hongos se dejaron crecer durante 3 días antes de exponer a los insectos a los COVBs producidos por estos. Los controles se realizaron usando placas Petri con 18 ml de PDA no cultivadas. Por otro lado, los recipientes donde se mantienen las poblaciones de A. obtectus fueron limpiados de adultos 3 días antes del experimento, de modo que los insectos añadidos tuvieran una edad homogénea controlada de entre 0 y 3 días. Adicionalmente, se contaron y pesaron grupos de 40 alubias de la variedad “Riñón Menudo” pertenecientes a la IGP “Alubia de La Bañeza-León” para su introducción junto con los insectos en cada una de las réplicas experimental. Las cámaras se montaron del siguiente modo: la placa con el hongo se emplazó boca arriba retirándosele la tapa, sobre ella se colocó la pieza intermedia de la VOC Chamber, cuya superficie superior, incluyendo el orificio central se cubrió con una membrana de celofán y un papel de filtro estériles, de modo que permitiesen el paso de los COVBs pero impidieran a los insectos acceder a la parte inferior, evitando también contaminaciones cruzadas por esporas fúngicas. Sobre el papel se colocaron 40 alubias y 20 adultos de A. obtectus sin sexar. Finalmente, estos se cubrieron con una placa Petri vacía boca abajo. En la disposición sellada del experimento el contacto entre ambas placas y la pieza central fue sellada empleando parafilm. Para la disposición no sellada solamente la placa inferior con el hongo fue sellada con parafilm, mientras que la superior conteniendo las alubias y los insectos se mantuvo sin sellar, para permitir un mayor intercambio de gases con el exterior. Las cámaras se colocaron a 25ºC en oscuridad. La mortalidad de los insectos fue evaluada diariamente hasta pasar 16 días. Se realizaron 5 réplicas por tratamiento y condición (sellada y no sellada). Tras esto, las placas inferiores y las piezas centrales se descartaron y los cadáveres de los insectos fueron retirados de la placa conteniendo las alubias, que se cerraron con nuevas tapas. Estos cadáveres se cultivaron en medio Rosa de Bengala-Cloranfenicol, para comprobar que no había entrado en contacto físico con los T. harzianum. Por otro lado, las placas con las 40 semillas de cada réplica se colocaron de nuevo a 25ºC en oscuridad hasta que el primer adulto de la F1 emergió de las mismas. Este momento fue determinado como día 1 del experimento de emergencia. A partir de aquí, la emergencia de nuevos adultos se contabilizó diariamente hasta el día 23, habiendo cesado la misma de forma general en torno al día 20. Finalmente, las alubias de cada réplica se pesaron para calcular la pérdida de peso sufrida y se contó el número de alubias afectadas, el número de orificios por alubia individualmente y el número total de orificios por réplica. De este modo se dispuso de datos relevantes sobre los daños producidos por A. obtectus sobre alubias estando expuesto a COVBs de diferentes cepas fúngicas. 6. Identificación y cuantificación de los COVBs producidos por T. harzianum T34 y E20 mediante (CG/EM) Las cepas fúngicas se sembraron y dejaron crecer a 25ºC durante 3 días en frascos de 50 ml con 10 ml de agar en posición horizontal. Tras esto, la extracción se llevó a cabo microextracción en fase sólida (HS-SPME) y se analizó empleando Cromatografía de gases y Espectrometría de Masas (CG/EM). La fibra de adsorción empleada fue divinylbenzeno/carbonex/polydimethylsiloxano (DVB/CAR/PDMS 50/30 µm) SPME, empleando la metodología de muestreo descrita por Malheiro et al., (2018). Las muestras se mantuvieron a 25ºC durante 5 minutos y posteriormente se expuso la fibra durante 30 minutos. Tras extraerse, ésta se eluyó en el puerto de inyección del CG/EM mediante desorción térmica a 220ºC. El análisis se realizó en un cromatógrafo Shimadzu GC-2010 unido a un detector espectrómetro Shimadzu GC/MS-QP2010 SE. Se empleó helio como fase móvil a 30 cm/s. Se programó una rampa de temperatura partiendo de 40ºC más 2ºC/min hasta alcanzar 220ºC. La temperatura de la fuente de ionización fue de 250ºC, con una energía de 70 eV y corriente de ionización de 0.1 KV. El rango de ionización para los espectros de masa fue de 35-500 m/z. Para su identificación, los espectros fueron comparados a la base de datos del NIST 11, y el porcentaje de los picos determinado integrando el área empleando el ion base específico para cada uno de ellos. 7. Análisis estadísticos De forma general, para todos los conjuntos de datos se evaluó la normalidad y homocedasticidad de las muestras empleando para ello el método de Kolgomorov-Smirnov y la prueba de Levene. Los datos que cumplieron estas condiciones se analizaron análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguidos de la prueba post hoc de Tukey, mayoritariamente aplicando p ≤ 0.05, aunque para la comparativa de metodologías entre DDS y VOC Chambers se evaluaron para p ≤ 0.05; p ≤ 0.01 y p ≤ 0.001. En los datos de los experimentos con insectos la prueba de contraste empleada fue la de Diferencia Mínima Significativa (p ≤ 0.05). En el caso de tratarse de únicamente dos muestras de datos se utilizó la prueba de t de Student (p ≤ 0.05). Por último, en el caso de no cumplirse las condiciones de normalidad o de igualdad de varianzas, se empleó la prueba no paramétrica H de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba U de Mann-Whitney (p ≤ 0.05). Para todos los análisis se empleó el programa IBM SPSS Statistics 26. 8. Dispositivos desarrollados para la realización de ensayos in vitro de interacción mediada por COVBs Se describen a continuación las invenciones que han sido desarrolladas y patentadas para llevar a cabo de forma fiable y eficiente los experimentos de interacción mediada por compuestos volátiles. Dado que son el elemento metodológico central de la tesis, su descripción se realizará en este resumen de forma más pormenorizada. 8.1. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles (VOC Chamber) Es objeto de la invención una cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles que comprende: un primer receptáculo, un segundo receptáculo, y una pieza central entre el primer receptáculo y el segundo receptáculo. Los receptáculos comprenden una pared externa y una pared perimetral perpendicular a la pared externa, y la pieza central comprende una pared intermedia con al menos un orificio, y dos paredes laterales que se proyectan desde el perímetro de la pared intermedia en direcciones opuestas. En la placa objeto de la invención las paredes laterales de la pieza central rodean las paredes perimetrales de los receptáculos y las paredes perimetrales de los receptáculos se apoyan en la pared intermedia. En otra realización, la pared intermedia de la pieza central comprende una primera cara enfrentada con el primer receptáculo y una segunda cara enfrentada con el segundo receptáculo, donde al menos una de las caras comprende salientes. En otra realización, la pieza central comprende un reborde interno en al menos una de las caras de la pared intermedia, tal que el reborde interno y la pared lateral configuran un alojamiento para el extremo de la pared externa de un receptáculo. En otra realización, la pared intermedia comprende una pluralidad de pestañas en la primera cara y/o en la segunda cara donde se apoya la pared externa de un receptáculo. En otra realización, comprende una membrana o filtro cubriendo el orificio de la pared intermedia de la pieza central, donde la membrana o filtro son porosos permitiendo el paso del aire y compuestos volátiles, y bloqueando el paso de elementos de mayor tamaño. La cámara comprende un primer reborde situado en la pared externa del primer receptáculo, y un segundo reborde de diámetro ligeramente diferente situado en la pared externa del segundo receptáculo, tal que las paredes externas de un primer receptáculo y un segundo receptáculo, el primer reborde encaja en el segundo reborde impidiendo el movimiento relativo entre dos placas de cultivo apiladas. En otra realización la cámara comprende al menos un tabique en al menos un receptáculo, tal que el tabique divide en partes independientes el interior de dicho receptáculo. Descripción de los dibujos Las distintas referencias numéricas que se encuentran reflejadas en las figuras y el texto corresponden a los siguientes elementos: 1. primer receptáculo, 2. segundo receptáculo, 3. pieza central, 4. pared externa, 5. pared perimetral, 6. pared intermedia, 7. pared lateral, 8. primera cara, 9. segunda cara, 10. reborde interno, 11. alojamiento, 12. pestañas, 13. orificio, 14. membrana o filtro, 15. tabique, 16. primer reborde, y 17. segundo reborde. Reivindicaciones 1. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles, caracterizada por que comprende: - un primer receptáculo (1), - un segundo receptáculo (2), y - una pieza central (3) entre el primer receptáculo (1) y el segundo receptáculo (2), donde los receptáculos (1, 2) comprenden una pared externa (4) y una pared perimetral (5) perpendicular a la pared externa (4), y donde la pieza central (3) comprende una pared intermedia (6) con al menos un orificio (13), y dos paredes laterales (7) que se proyectan desde el perímetro de la pared intermedia (6) en direcciones opuestas, tal que las paredes laterales (7) de la pieza central (3) rodean las paredes perimetrales (5) de los receptáculos (1, 2) y las paredes perimetrales (5) de los receptáculos (1, 2) se apoyan en la pared intermedia (6) de la pieza central (3). 2. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles según la reivindicación 1, caracterizada por que la pared intermedia (6) de la pieza central (3) comprende una primera cara (8) enfrentada con el primer receptáculo (1) y una segunda cara (9) enfrentada con el segundo receptáculo (2), donde la primera cara (8) y la segunda cara (9) son lisas. 3. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles según la reivindicación 1, caracterizada por que la pared intermedia (6) de la pieza central (3) comprende una primera cara (8) enfrentada con el primer receptáculo (1) y una segunda cara (9) enfrentada con el segundo receptáculo (2), donde al menos una de las caras (8, 9) comprende una pluralidad de pestañas (12) donde se apoya la pared perimetral (5) de un receptáculo (1, 2), facilitando así el intercambio gaseoso con el exterior. 4. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la pieza central (3) comprende un reborde interno (10) en al menos una de las caras (8, 9) de la pared intermedia (6), tal que el reborde interno (10) y la pared lateral (7) configuran un alojamiento (11) para el extremo de la pared perimetral (5) de uno o ambos receptáculos (1, 2) quedando así enclavados. 5. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que comprende una membrana o filtro (14) cubriendo el orificio (13) de la pared intermedia (6) de la pieza central (3), donde la membrana o filtro (14) es porosa permitiendo el paso del aire y compuestos volátiles, y bloqueando el paso de elementos de mayor tamaño. 6. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que comprende: un primer reborde (16) situado en la pared externa (4) del primer receptáculo (1), y un segundo reborde (17) situado en la pared externa (4) del segundo receptáculo (2), donde enfrentado las paredes externas (4) de un primer receptáculo (1) y un segundo receptáculo (2), el primer reborde (16) encaja en el segundo reborde (17) impidiendo el movimiento relativo entre dos placas de cultivo apiladas. 7. Cámara de cultivo para ensayos microbiológicos de competencia mediante compuestos volátiles según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que comprende al menos un tabique (15) en al menos un receptáculo (1, 2), tal que el tabique (15) divide en partes independientes el interior de dicho receptáculo (1, 2). 8.2. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo (p-mVOC Chamber) La presente invención se refiere a una cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo. La cámara de cultivo objeto de la invención es de aplicación en el campo de la investigación in vitro en botánica, fisiología vegetal y agricultura, y más concretamente en la categoría de recipientes y cámaras para el cultivo in vitro de plantas o partes de plantas. La cámara de cultivo permite evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo; así como el efecto de estos mismos compuestos volátiles sobre plagas o enfermedades de plantas cuando se encuentran interaccionando con estas; o, adicionalmente, la evaluación de los efectos producidos por compuestos volátiles emitidos por plantas o alguna de sus partes sobre otros organismos. La presente cámara comprende: un primer receptáculo, un segundo receptáculo, y una pieza central entre el primer receptáculo y el segundo receptáculo. Los receptáculos comprenden una pared externa y una pared perimetral perpendicular a la pared externa, y donde la pieza central comprende una pared intermedia con al menos un primer orificio, y dos paredes laterales que se proyectan desde el perímetro de la pared intermedia en sentidos opuestos, tal que las paredes laterales de la pieza central rodean las paredes perimetrales de los receptáculos y las paredes perimetrales de los receptáculos se apoyan en la pared intermedia de la pieza central. La pared perimetral del primer receptáculo tiene una altura diferente a la pared perimetral del segundo receptáculo. En la cámara de cultivo la pared intermedia de la pieza central comprende una primera cara enfrentada con el primer receptáculo y una segunda cara enfrentada con el segundo receptáculo, donde la primera cara y la segunda cara son lisas. La pared intermedia de la pieza central comprende una primera cara enfrentada con el primer receptáculo y una segunda cara enfrentada con el segundo receptáculo, donde al menos una de las caras puede comprender una pluralidad de pestañas donde se apoya la pared perimetral de un receptáculo, facilitando así el intercambio gaseoso con el exterior. La pieza central puede comprender un reborde interno en al menos una de las caras de la pared intermedia, tal que el reborde interno y la pared lateral configuran un alojamiento para el extremo de la pared perimetral de uno o ambos receptáculos quedando así enclavados. Además, la pieza central puede comprender un reborde en al menos una de las caras de la pared intermedia, tal que el reborde y la pared intermedia están configurados para alojar una membrana o filtro y/o para evitar el goteo de líquidos desde la primera cara. También puede comprender una membrana o filtro cubriendo el primer orificio de la pared intermedia de la pieza central, donde la membrana o filtro es porosa y permite el paso del aire y compuestos volátiles, y bloquea el paso de elementos de mayor tamaño. La pared perimetral de al menos un receptáculo puede comprender un segundo orificio cubierto por un septo, diafragma o válvula, tal que el segundo orificio impide la libre salida de gases al exterior a través de dicho segundo orificio y permite la extracción de los mismos del interior de la cámara mediante punción con elementos de tipo jeringuilla o unión mediante un tubo. Finalmente, puede presentar al menos un tabique en al menos un receptáculo, tal que el tabique divida en partes independientes el interior de dicho receptáculo. Descripción de los dibujos Las distintas referencias numéricas que se encuentran reflejadas en las figuras y el texto corresponden a los siguientes elementos: 1. primer receptáculo, 2. segundo receptáculo, 3. pieza central, 4. pared externa, 5. pared perimetral, 6. pared intermedia, 7. pared lateral, 8. primera cara, 9. segunda cara, 10. pestañas, 11. primer orificio, 12. segundo orificio, 13. membrana o filtro, 14. reborde, 15. reborde interno, 16. alojamiento Reivindicaciones 1. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo, que comprende un primer receptáculo (1), un segundo receptáculo (2), y una pieza central (3) entre el primer receptáculo (1) y el segundo receptáculo (2), donde los receptáculos (1, 2) comprenden una pared externa (4) y una pared perimetral (5) perpendicular a la pared externa (4), y donde la pieza central (3) comprende una pared intermedia (6) con al menos un primer orificio (11), y dos paredes laterales (7) que se proyectan desde el perímetro de la pared intermedia (6) en sentidos opuestos, tal que las paredes laterales (7) de la pieza central (3) rodean las paredes perimetrales (5) de los receptáculos (1, 2) y las paredes perimetrales (5) de los receptáculos (1, 2) se apoyan en la pared intermedia (6) de la pieza central (3), caracterizado por que la pared perimetral (5) del primer receptáculo (1) tiene una altura diferente a la pared perimetral (5) del segundo receptáculo (2). 2. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo según la reivindicación 1, caracterizada por que la pared intermedia (6) de la pieza central (3) comprende una primera cara (8) enfrentada con el primer receptáculo (1) y una segunda cara (9) enfrentada con el segundo receptáculo (2), donde la primera cara (8) y la segunda cara (9) son lisas. 3. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo según la reivindicación 1, caracterizada por que la pared intermedia (6) de la pieza central (3) comprende una primera cara (8) enfrentada con el primer receptáculo (1) y una segunda cara (9) enfrentada con el segundo receptáculo (2), donde al menos una de las caras (8, 9) comprende una pluralidad de pestañas (10) para apoyo de la pared perimetral (5) de un receptáculo (1, 2) para intercambio de gases con el exterior. 4. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la pieza central (3) comprende un reborde interno (15) en al menos una de las caras (8, 9) de la pared intermedia (6), tal que el reborde interno (15) y la pared lateral (7) configuran un alojamiento (16) para el extremo de la pared perimetral (5) de uno o ambos receptáculos (1, 2) quedando así enclavados. 5. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la pieza central (3) comprende un reborde (14) en al menos una de las caras (8, 9) de la pared intermedia (6), tal que el reborde (14) y la pared intermedia (6) están configurados para alojar una membrana o filtro (13). 6. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que comprende una membrana o filtro (13) cubriendo el primer orificio (11) de la pared intermedia (6) de la pieza central (3). 7. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que la pared perimetral (5) de al menos un receptáculo (1, 2) comprende un segundo orificio (12) cubierto por un septo, diafragma o válvula, configurado para extraer volátiles. 8. Cámara de cultivo para evaluar los efectos de compuestos volátiles en las interacciones planta-microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que comprende al menos un tabique en al menos un receptáculo (1, 2), tal que el tabique divide en partes independientes el interior de dicho receptáculo (1, 2). PRINCIPALES RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Evaluación de la actividad antifúngica de autoinhibitoria de los metabolitos secundarios no volátiles producidos por Trichoderma spp. mediante ensayos de membrana En ensayos de membrana, Trichoderma spp. demostró una intensa actividad antifúngica frente a F. oxisporum. Esta actividad fue significativamente mayor para los aislados de T. harzianum que para el resto; T. velutinum, T. gamsii y T. citrinoviride. Por otro lado, los resultados obtenidos en el ensayo de autoinhibición fueron muy similares. En el primer día de la toma de datos 5 de los 10 Trichoderma no mostraron diferencias entre autoinhibición y la inhibición sobre F. oxysporum. Esta proporción subió a 7 de 10 en el segundo día de toma de medidas, mostrando este efecto todos los T. harzianum estudiados. Además, de entre los aislados que mostraron diferencias, dos de ellos presentaron mayor autoinhibición que actividad antifúngica frente a F. oxysporum. Estos resultados sugieren que en las condiciones in vitro que se producen en los ensayos de membrana, la extremadamente alta concentración de sustancias tóxicas que se acumulan no solo afectan de forma significativa a otros microorganismos, sino también al propio ACB. DE este modo, no parece que los resultados obtenidos puedan ser razonablemente extrapolados a condiciones naturales, poniendo además en tela de juicio la utilidad real de estos ensayos por si mismos para seleccionar preliminarmente aislados fúngicos con potencial actividad como ACB. En este sentido, ensayos de autotoxicidad podrían ser de utilidad para afinar de forma más precisa esta selección de ACBs, eligiéndose aquellas que no sólo producen la mayor inhibición sobre el patógeno, sino que también tengan mayor capacidad de resistir sus propios metabolitos tóxicos. 2. Evaluación del prototipo “VOC Chaber” y de los efectos producidos por COVBs de T. harzianum sobre F. oxysporum y R. solani. En primer lugar, las nuevas cámaras de cultivo “VOC Chambers” mostraron una reducción significativa del coeficiente de variación respecto al método tradicional de placas enfrentadas (DDS), indicando que aportan una mayor homogeneidad de resultados a estos experimentos, lo cual de por sí ya es una característica relevante. Adicionalmente, tanto el modelo ventilado como el no ventilado pusieron de manifiesto diferencias estadísticamente significativas entre cepas de T. harzianum que no fueron reveladas por el método DDS, indicando que la nueva tecnología tiene una mayor capacidad de discernir diferencias en la actividad antifúngica de diferentes COVBs. A nivel general, la actividad inhibitoria sobre los patógenos se redujo con el incremento de intercambio de gases entre el sistema y el exterior. Además, el estudio de la actividad de los COVBs de T. harzianum sobre F. oxysporum empleando cámaras ventiladas mostró que la inhibición de crecimiento que producen estos COVBs sobre el patógeno en condiciones selladas se convierte en una actividad promotora del crecimiento en condiciones ventiladas para las cepas T34 y E20. Por otro lado, las cepas productoras de trichodieno (T34-5.27 y E20-5.7) produjeron un incremento significativo de la inhibición en comparación con sus parentales. Sin embargo, no se puede asignar con seguridad este efecto al trichodieno sin realizar nuevos experimentos empleando el compuesto puro. Estas cepas mostraron actividad inhibitoria incluso en condiciones ventiladas. Estos resultados muestran que las cámaras de cultivo “VOC Chambers” son una tecnología fiable y eficiente para la realización de ensayos de competencia microbiana mediados por COVBs, y que estos dispositivos podrían convertirse en un estándar metodológico en investigación. Además, nuevos usos podrían ser desarrollados por la comunidad científica para estos dispositivos. 3. Evaluación del prototipo “p-mVOC Chaber” y de los efectos producidos por COVBs de T. harzianum sobre plántulas de trigo (Triticum aestivum var. tremie) Las cámaras de cultivo “p-mVOC Chamber” mostraron ser un método funcional para la evaluación de los efectos producidos por COVBs microbianos sobre semillas y plántulas. En este sentido se observaron diferencias moderadas en la tasa de germinación de semillas de trigo en los tratamientos control y en aquellos expuestos a COVBs de T. harzianum. T34 y E20 indujeron significativamente el crecimiento en longitud de la parte aérea en comparación con el control, así como su peso fresco. Estas cepas no modificaron la longitud y el peso fresco de la raíz, pero si redujeron el peso seco de estas últimas. Por otro lado, la cepa productora de trichodieno T34-5.27 redujo significativamente la longitud, el peso fresco y el peso seco de la parte aérea, y redujo igualmente de forma significativa la longitud y el peso seco de la raíz, todo en referencia a los datos obtenidos para el tratamiento control sin hongo. Además, se observaron importantes diferencias entre esta cepa de T. harzianum y las otras dos, con T34-5.27 produciendo una reducción generalizada de los parámetros de crecimiento medidos en las plántulas de trigo. En lo referente a indicadores de fotosíntesis no se observaron diferencias significativas entre ninguno de los tratamientos ni en contenido total de clorofila ni en rendimiento cuántico. Esto parece indicar que las diferencias observadas a nivel de desarrollo no estarían relacionadas con efectos sobre los procesos fotosintéticos de la planta. 4. Empleo de “VOC Chambers” para la valuación de los efectos producidos por COVBs de T. harzianum sobre A. obtectus y los daños que este produce sobre alubias Los COVBs producidos por las diferentes cepas de T. harzianum produjeron un significativo incremento respecto al control en la mortalidad de adultos de A. obtectus expuestos a los mismos en condiciones selladas, mientras que, en condiciones no selladas, donde se produce una mayor ventilación e intercambio de gases con el exterior, apenas se observaron diferencias en la mortalidad. Las cepas superproductoras de escualeno E20 y E20-5.7 produjeron un incremento muy significativo de actividad insecticida respecto a T34 y T34-5.27 en condiciones selladas. El incremento en la mortalidad de adultos se tradujo en una menor emergencia de insectos de las alubias en la siguiente generación. De nuevo, esta reducción fue mayor para E20 y E20-5.7. Cabe destacar que, a pesar de no observarse diferencias en la actividad insecticida sobre los adultos en condiciones no selladas, sí se redujo significativamente el número de nuevos insectos emergidos, siendo de nuevo E20 y E20-5.7 los que produjeron una mayor reducción. Esto parece indicar que los COVBs de T. harzianum producen toxicidad sobre otras fases de desarrollo del insecto (huevos, larvas) o que inducen cambios en el comportamiento reproductivo de los mismos. En lo referente a los daños producidos por A. obtectus en las alubias, estos se redujeron cuando los insectos se encontraban expuestos a los COVBs microbianos. En condiciones selladas la reducción fue significativamente mayor en aquellos expuestos a E20 y E20-5.7, en paralelo al incremento de mortalidad y reducción en emergencia. En condiciones no selladas los daños en las alubias también se redujeron significativamente con respecto al control, pero no de forma tan marcada ni para todos los parámetros. Se redujeron significativamente el porcentaje de alubias afectadas y el número total de orificios, pero esta reducción no fue estadísticamente significativa en el caso del número de orificios por alubia afectada ni el porcentaje total de pérdida de peso. Los resultados referidos sugieren que uno o varios COVBs producidos por las cepas de T. harzianum estudiadas podrían ser útiles para el control de A. obtectus como plaga de alubias y otros granos almacenados, con el objetivo de reducir las pérdidas causadas por este insecto. Estos compuestos podrían ser una alternativa natural y menos tóxica que los compuestos de síntesis química empleados como insecticidas en la actualidad. Por tanto, nuevos estudios empleando COVBs aislados y purificados de estas cepas frente a A. obtectus y otros insectos plaga de almacén serían de gran interés. 5. Identificación y cuantificación preliminar de los COVBs producidos por T. harzianum T34 y E20 mediante (CG/EM) Se identificaron y cuantificaron mediante CG/EM los COVBs producidos por las cepas T34 y E20 en condiciones selladas. Posteriormente se compararon los niveles de producción para cada uno de ellos. Preliminarmente, se analizaron estas diferencias entre los 8 compuestos mayoritarios. T34 mostró una producción significativamente mayor de Isobutyl acetate (18.66 ± 1.6%) y 1-Butanol, 3-methyl-, acetate (41.11 ± 2.72%), mientras que E20 produjo significativamente mayor cantidad de 1-Propanol, 2-methyl- (23.85 ± 2.73%); Acetoin (12.09 ± 1.27%); 1-Butanol, 3-methyl- (15.19 ± 1.36%); Phenylethyl Alcohol (5.07 ± 0.81%); Benzeneacetic acid, ethyl ester (0.29 ± 0.04%); y Naphthalene, 1,2,3,4,4a,7-hexahydro-1,6-dimethyl-4-(1-methylethyl)- (2.59 ± 0.5%). La suma de estos 8 compuestos supuso para ambas cepas más del 90% de COVBs producidos. Como se ha referido en el apartado anterior, cabe esperar que COVBs producidos en diferente proporción por estas cepas de T. hazianum sean los responsables de las diferentes actividades biológicas que han sido descritas en los capítulos anteriores. Sin embargo, otros compuestos minoritarios también podrían ser responsables total o parcialmente. Por tanto, es necesario completar estos resultados preliminares con nuevos análisis y evaluaciones de los efectos de los compuestos aislados.   CONCLUSIONES PRIMERA: Los metabolitos solubles no volátiles producidos y liberados por cepas de Trichoderma spp. aisladas de campos de judía común (P. vulgaris) pertenecientes a la IGP “Alubia de la Bañeza-León inhiben significativamente el crecimiento de un aislado fitopatogénico de Fusarium oxysporum en ensayos in vitro de membrana. SEGUNDA: Todos los aislados de Trichoderma spp. evaluados muestran actividad auto-inhibitoria mediada por metabolitos solubles no volátiles en ensayos in vitro de membrana, viéndose significativamente inhibido su crecimiento micelial y alterada la morfología de las colonias fúngicas. Estos efectos inhibitorios del crecimiento son mayoritariamente comparables a aquellos ejercidos sobre Fusarium oxysporum en las mismas condiciones. TERCERA: Una nueva Cámara de Compuestos Orgánicos Volátiles (VOC Chamber) ha sido diseñada (Número de patente: ES 2708899 B2), la cual demuestra ser un dispositivo fiable y eficiente para la evaluación de interacciones volátiles entre diferentes microorganismos y entre microorganismos e insectos. CUARTA: Esta nueva tecnología consume menos tiempo en su empleo que el método tradicional de dos placas Petri enfrentadas (DDS), incrementa significativamente la homogeneidad y replicabilidad de los resultados, permite detectar diferencias no detectadas por métodos tradicionales y aporta flexibilidad a las condiciones experimentales, especialmente en lo referente a ventilación e intercambio de gases con el entorno. QUINTA: Los efectos inhibitorios producidos por Compuestos Orgánicos Volátiles Biogénicos (COVBs) emitidos por aislados de T. harzianum sobre R. solani y F. oxysporum difieren considerablemente entre condiciones ventiladas, no ventiladas y selladas. Los efectos inhibitorios sobre el crecimiento decrecen de forma general a medida que la ventilación se incrementa, hasta el punto de que la inhibición producida por COVBs de T. harzianum sobre F. oxysporum en condiciones selladas pasa a ser promoción del crecimiento en condiciones ventiladas. SEXTA: Los COVBs emitidos por T. harzianum presentan propiedades insecticidas frente a Acanthoscelides obtectus y reducen los daños producidos por este insecto sobre alubias, siendo estos efectos generalmente menores en condiciones de mayor ventilación. SÉPTIMA: Una nueva Cámara de Compuestos Orgánicos Volátiles planta-microorganismo (p-mVOC Chamber) ha sido diseñada (Número de solicitud del Modelo de Utilidad: U202131032), la cual demuestra ser un método eficiente para la evaluación de las interacciones entre plantas y microorganismos mediadas por COVBs y para la búsqueda de aislados microbianos productores de COVBs con posible actividad biológica sobre plantas. OCTAVA: El silenciamiento del gen erg1 en T. harzianum, con la subsecuente reducción en los niveles de ergosterol e incremento de los de escualeno, reduce la actividad antifúngica de los COVBs producidos por esta cepa frente a R. solani y F. oxysporum, incrementa sus propiedades insecticidas contra A. obtectus, reduciendo el daño producido por este insecto en alubias, y no modifica su actividad promotora del crecimiento en plántulas de trigo, todo ello en comparación con los efectos producidos por la cepa silvestre. NOVENA: La introducción del gen tri5 de T. arundinaceum en T. harzianum, con la subsecuente sobreproducción del volátil trichodieno, incrementa la actividad antifúngica de los COVBs producidos por esta cepa sobre R. solani y F. oxysporum, no modifica sus propiedades insecticidas frente a A. obtectus e incrementa su inhibición del crecimiento de plántulas de trigo, todo ello en comparación con los efectos producidos por la cepa silvestre. DÉCIMA: El silenciamiento del gen erg1 en T. harzianum induce diferencias significativas en la cantidad de COVBs específicos producidos por esta cepa en comparación con los de la silvestre, con menor emisión de Isobutyl acetato y 1-Butanol, 3-methyl-, acetato; y mayor emisión de 1-Propanol, 2-methyl-; Acetoina; 1-Butanol, 3-methyl-; Phenylethyl Alcohol; Ácido benzeneacético, ethyl ester; y Naphthaleno, 1,2,3,4,4a,7-hexahydro-1,6-dimethyl-4-(1-methylethyl)-. Estas diferencias pueden ser responsables de algunos de los efectos volátiles descritos para estas cepas de T. harzianum.es_ES
dc.languageenges_ES
dc.subjectIngeniería agrícolaes_ES
dc.subject.otherPesticidases_ES
dc.titleNew "in vitro" approaches and technologies to evaluate the biological activity of microbial secondary metabolites in plants, plant pathogens and pests = Nuevos enfoques y tecnologías para evaluar la actividad biológica de los metabolitos secundarios microbianos en plantas, patógenos de plantas y plagases_ES
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesises_ES
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dc.subject.unesco2414 Microbiologíaes_ES
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dc.subject.unesco3108.02 Control Biológico de Enfermedadeses_ES
dc.subject.unesco3108.05 Hongoses_ES


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