Detección de daño oxidativo en el ADN del espermatozoide porcino mediante inmunocitoquímica de 8-OHDG

Abstract

El ganado porcino tiene una gran importancia económica, y su producción se basa principalmente en la inseminación artificial. El objetivo de este trabajo es la optimización y puesta a punto del protocolo de inmunodetección de la 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG). Un marcador temprano de la oxidación del ADN. La 8-OHdG permite detectar el daño del ADN causado por el estrés oxidativo que puede no ser detectado por métodos clásicos de evaluación de muestras espermáticas, y que constituye una de las principales causas de infertilidad masculina. El fin último que se persigue es su aplicación en citometría de flujo para evaluar miles de células por segundo. Se realizaron varios tratamientos empleando diferentes combinaciones de reactivos, concentraciones y tiempos de incubación, mediante la técnica de inmunocitoquímica. Las muestras espermáticas se observaron en un microscopio de fluorescencia y posteriormente fueron analizadas con el programa ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia. Atendiendo a los resultados obtenidos, las muestras espermáticas que presentaron mayor fluorescencia fueron las procesadas con el tratamiento de descondensación con 10 mM DTT y permeabilización con Citrato sódico 0,1% en Triton 0,1%. Habiendo comprobado los buenos resultados de esta técnica, el siguiente paso sería analizar muestras espermáticas de verracos y correlacionarlos con sus datos de fertilidad, evaluando si tiene mayor valor predictivo que las técnicas tradicionales, siendo entonces muy útil para los centros de inseminación, que podrían identificar de manera temprana los verracos subfértiles, reduciendo costes.