Characterization of physiological and molecular responses in common bean upon "Pseudomonas syringae" pv. "phaseolicola" infection: the role of pectins in the defensive processes

Abstract

[ES] Las plantas normalmente están sometidas a todo tipo de estreses, entre ellos los causados por patógenos, que dificultan su supervivencia. Pese a ser organismos sésiles, las plantas han desarrollado un verdadero y completo sistema inmune para combatir a estos atacantes, el cual está finamente regulado. Así, durante el ataque de un patógeno, las células de la planta desencadenan una serie de mecanismos, que de ser eficientes, evitan la dispersión del patógeno por la planta y por tanto la enfermedad. Una de las respuestas más rápidas, es la liberación de peróxido de hidrógeno y otras especies reactivas de oxígeno (ROS), que sirven como antimicrobiano pero también como moléculas de señalización junto con el calcio. Esta señalización induce la rápida liberación de hormonas, como el ácido salicílico (SA) en el caso de patógenos biotrofos, las cuales desencadena una respuesta hipersensible (HR) que bloquea el avance del patógeno. Si la planta es resistente al patógeno, será muy eficiente y rápida activando estos mecanismos, y bloqueará rápidamente el avance del patógeno. La mayoría de estos procesos se han estudiado en plantas resistentes a un determinado patógeno, pero se sabe poco de qué ocurre durante una interacción en la que la planta es susceptible, lo que sería interesante para desarrollar estrategias para reducir la enfermedad. Además, en estos procesos de inmunidad, la pared celular, al ser la primera barrera física, juega un papel importante. De la capacidad de la planta para remodelar la arquitectura de la pared celular y, consecuentemente, sus propiedades fisicoquímicas, dependerá que el patógeno sea capaz o no de penetrar en la célula.

Uno de los pato-sistemas que puede servir de modelo para conocer en mayor profundidad los procesos de patogenicidad, es el formado por la alubia común (Phaseolus vulgaris L.) y Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Pph), que produce la enfermedad de la grasa. Los principales síntomas son clorosis, problemas en el crecimiento y manchas características en hojas, tallo y vainas, lo que conlleva una menor producción. El estudio de esta enfermedad desde el punto de vista fisiológico es muy importante para la provincia de León, ya que dentro de su IGP recae casi el 50% de la producción de alubia a nivel nacional. De todas sus variedades, la alubia variedad Riñón es la más apreciada y rentable a nivel económico, pero es muy susceptible al ataque de la bacteria.

Esta tesis ha tenido como objetivo obtener más información sobre los procesos fisiológicos que podrían explicar la susceptibilidad de la alubia común variedad Riñón a la bacteria Pph, centrándonos en el papel principal que puede tener la remodelación de la pared celular, especialmente las pectinas, para obtener una solución que active de alguna manera la inmunidad de la alubia.

Nuestras hipótesis de partida son que Pph inhibe el sistema inmune de la alubia Riñón en algún punto durante la infección, probablemente al inicio, lo cual desencadena la enfermedad. De conocer este mecanismo de inhibición o encontrar el punto de la ruta de defensa que es bloqueado, sería posible buscar una solución para evitarlo. Por otro lado, si somos capaces de activar o reforzar el sistema de defensa de la alubia, sería posible reducir los efectos de la enfermedad o incluso evitarla por completo. Además, creemos que la pared celular puede jugar un papel clave en la defensa y reconocimiento del patógeno. Para abordar estos estudios, hemos realizado una serie de experimentos in vitro con el fin de forzar la infección con la bacteria evitando la interferencia con otros estreses, y poder estudiar qué ocurre en los primeros momentos de la infección tanto a nivel fisiológico como molecular. Además, se han llevado a cabo experimentos de elicitación del sistema inmune de la alubia, tanto con compuestos químicos como el INA, como con preparados a base de plantas (PBPs), y se ha realizado un análisis de los cambios que se producen en la pared celular de alubia tras la infección y/o elicitación de la planta. De esta manera, se establecieron 4 objetivos parciales que constituyeron cada uno de los capítulos de esta tesis.

Objetivo 1: estudiar la percepción y primeras respuestas de defensa que se activan en la alubia común variedad Riñón tras la infección con Pph (capítulo I). Para ello se analizaron algunas respuestas típicas de PTI, como son la producción masiva de ROS y el influjo de calcio, actividades antioxidantes, fitohormonas relacionadas con defensa, como el ácido salicílico y el ácido abscísico, y el análisis de expresión de genes relacionados con defensa. Además, se identificaron in silico 6 receptores WAK, cuya expresión también se analizó. Como resultado, se obtuvo que al menos PvWAK1 aumenta su expresión a los pocos minutos tras la infección, lo que podría indicar un posible papel en defensa. Además, se produjo un incremento del H2O2 total y apoplástico y un aumento en la expresión de PR1, pero no una activación del sistema antioxidante y, sobre todo, no se detectó un pico de SA, lo que probablemente evitó la activación de HR. En nuestra variedad de alubia, la falta de estos mecanismos defensivos conllevó un daño celular temprano y alta susceptibilidad a Pph. El hecho de que la expresión de PvWAK1 aumentara después de la infección con Pph podría indicar que los efectores de la bacteria no inhibieron la expresión de este receptor, al menos en etapas tempranas, y podría ser interesante considerarlo en programas de mejora o de ingeniería genética. Finalmente, también este estudio abre la puerta a investigar si la aplicación de oligómeros para activar las respuestas de defensa en alubia a través de los receptores PvWAK.

Objetivo 2: conocer si el sistema inmune de esta variedad de alubia podía ser activado previamente a la infección, y si esta activación conllevaba, al igual que la infección por sí misma, una remodelación de la pared celular (capitulo II). Para ello, plantas pretratadas o no con un análogo estructural de SA, llamado INA, fueron inoculadas o no con Pph, y en ellas se realizó un análisis de sus paredes celulares y de activación del sistema de defensa mediante liberación de ROS. Como resultado, la activación del sistema inmune con INA produjo una mayor cantidad de ROS después de la incubación con flg22, y las plantas tratadas con INA fueron más resistente a la infección con Pph. La inoculación con Pph modificó la pared celular, pero en menor medida que cuando se activó el sistema inmune con INA. En general, la infección con Pph no modificó el contenido en celulosa, pero sí incrementó el de pectinas (homogalacturonano y ramnogalacturonano I) en fracciones pécticas (CDTA y Carbonato), y el de hemicelulosas (arabinoxilanos) en la fracción de hemicelulosas fuertemente unidas a la pared (fracción KII). La masa molecular de los polisacáridos aumentó sobre todo en la fracción carbonato, pero la pared celular resultó ser tan digerible enzimáticamente como la pared celular extraída de las plantas control. Por el contrario, el tratamiento con INA produjo un drástico remodelado de las paredes celulares extraídas. El contenido en celulosa aumentó, se produjo un desplazamiento entre las fracciones de los polisacáridos matriciales extraídos, así como un incremento de la masa molecular de los polisacáridos extraídos en cada fracción. Esto último podría estar relacionado con un incremento tanto en pectinas como en extensinas en todas las fracciones, lo que produjo un mayor entrecruzamiento entre polisacáridos dando lugar a una pared celular más resistente a la hidrólisis enzimática. La posterior inoculación con Pph en plantas pretratadas con INA, no modificó las paredes celulares respecto a las sólo tratadas con INA. Además, las plantas elicitadas con INA presentaron menos daños en sus hojas que las plantas control tras la infección con Pph.

Objetivo 3: obtener información de los genes implicados en la respuesta temprana de la alubia Riñón a Pph. Para ello, plantas de alubia de 15 días de edad fueron inoculadas o no con Pph, y transcurridas 2 o 9 horas de la infección, se extrajo el RNA para realizar un análisis transcriptómico mediante RNAseq (capítulo III). A las 2 horas tras la infección, se observó una sobreexpresión de genes relacionados con defensa, pero este incremento de expresión no se sostuvo a lo largo del tiempo. Esto también se observó cuando se cuantificaron fitohormonas relacionadas con defensa, como el salicílico, jasmónico y abscísico, y en la expresión de genes relacionados con pared celular. El análisis en monosacáridos de pared reveló un aumento en la cantidad de azúcares a las 2 horas post-infección, pero de nuevo disminuyó a las 9 horas, salvo para el GalA, lo que sugería un incremento de la síntesis de pectinas o una reducción de su degradación. Ésta segunda opción se confirmó al observar que la mayoría de las actividades relacionadas con degradación de pectinas (PL, PG y PME) había disminuido, mientras que la expresión de genes relacionados con enzimas inhibitorias de PME (PMEIs) aumentó. Esto podría ser una estrategia de protección de la pared celular de la planta frente a las actividades degradativas de pectinas que presenta Pph, como se ha observado en este trabajo. Otra posible estrategia de protección de la integridad de las pectinas, y por tanto de la pared celular, podría ser la formación de cajas de huevos, tal y como hemos observado mediante inmunohistoquímica. Para la formación de estas cajas de huevos es necesaria la desmetilación de las pectinas y aunque la actividad general PME disminuyó, algunos genes para PMEs, como el ortólogo de Arabidopsis PvPME17, aumentaron su expresión. Además, una explicación para que se viese disminuída la actividad PME podría ser la sobreexpresión de PMEIs. Entre otros, PvPMEI3, ortólogo de Arabidopsis de PMEI3, fue el que más aumentó su expresión. El análisis funcional de este gen se evaluó en mutantes de Arabidopsis pmei3, los cuales mostraron una susceptibilidad a Pph que los correspondientes controles no tenían. Finalmente, se demostró que PvPMEI3 tenía actividad PMEI, y podría jugar un papel clave en la resistencia de la alubia común frente a la infección por Pph.

Por último, el capítulo IV fue dedicado al cribado de preparaciones basadas en plantas por su capacidad de inhibición del crecimiento de Pph, así como probar si alguno de ellos era capaz de activar el sistema de defensa de la planta, evaluando algunos de los parámetros fisiológicos y moleculares relacionados con defensa previamente estudiados. En resumen, se probaron 4 preparaciones basadas en plantas, de las cuales 2 fueron las más efectivas (hollejo de uva tras la fermentación del vino y ortiga) para inhibir el crecimiento de Pph. Solo el tratamiento con ortiga conllevó la activación de algunos mecanismos de defensa, como los procesos de señalización redox y el aumento de los niveles de expresión de genes relacionados con defensa, sobre todo PR1. Las plantas de alubia tratadas con estos productos no disminuyeron su producción final. Los primeros ensayos in vitro, además, sugieren que la aplicación de ortiga puede proteger a la alubia de la infección con Pph. Todos estos resultados sugieren que las preparaciones a base de plantas de Urtica dioica podrían usarse en un futuro cercano para disminuir los efectos de la enfermedad de la grasa.

En definitiva, la presente tesis ha profundizado en los mecanismos de interacción en el patosistema alubia riñon-Pph, mostrando algunas de las posibles causas de susceptibilidad, como es la falta de producción de SA a tiempos cortos tras la infección, lo cual posiblemente impida que la alubia refuerce su pared celular y active otros mecanismos de defensa como HR y SAR. De hecho, hemos demostrado que la alubia puede ser elicitada con un análogo estructural de SA, lo cual conlleva un fuerte reforzamiento de pared que hace que la planta sea menos susceptible a Pph y tenga una pared celular más reforzada con pectinas y extensinas, y por tanto menos digerible enzimáticamente. El papel de las pectinas en el mecanismo de defensa ha quedado demostrado también a través del análisis de transcriptoma que hemos realizado en este trabajo, mediante el cual hemos comprobado que algunas enzimas implicadas en el metabolismo y modificación de las pectinas juegan un papel clave en el proceso de defensa, como PMEI3, cuya mutación en plantas de Arabidopsis conlleva que la planta muestre una susceptibilidad a Pph que los controles no tienen. Por último, hemos comprobado que la elicitación del sistema de defensa de la planta también es posible a través de productos basados en plantas, lo cual abre una puerta muy interesante para la generación de fitosanitarios ecológicos que se puedan aplicar en campo.

[EN] Plants are normally subjected to all kinds of stresses, including those caused by pathogens, which make their survival difficult. Despite being sessile organisms, plants have developed a true complete immune system to combat these attackers, which is tight regulated. Thus, during the attack of a pathogen, the plant cells trigger a series of mechanisms that, if efficient, prevent the spread of the pathogen by the plant and therefore the disease. One of the quickest responses is the release of hydrogen peroxide and other reactive oxygen species (ROS), which serve as antimicrobials but also as signaling molecules along with calcium. This signaling induces the rapid hormones release, such as salicylic acid (SA) in the case of biotrophic pathogens, which trigger a hypersensitive response (HR) that blocks the advance of the pathogen. If the plant is resistant to the pathogen, it will be very efficient and quick in activating these mechanisms, and it will quickly block the advance of the pathogen. Most of these processes have been studied in plants resistant to a certain pathogen, but little is known about what happens during an interaction where the plant is susceptible, which would be interesting in order to develop strategies to reduce the disease. Furthermore, in these immunity processes, the cell wall, being the first physical barrier, plays an important role. Whether or not the pathogen is able to penetrate the cell wall depend on the ability of the plant to remodel the architecture of the cell wall and, consequently, its physicochemical properties.

One of the pathosystems that can serve as a model to learn more about pathogenicity processes is that formed by common bean (Phaseolus vulgaris L.) and Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Pph), which causes halo blight disease. The main symptoms are chlorosis, growth problems and characteristic spots on leaves, stems and pods, which leads to lower production. The study of this disease physiologically is very important for the León region, since nearly 50% of the national common bean production comes from its PGI. Of all its varieties, the Riñón variety is the most appreciated and profitable economically, but it is very susceptible to the bacteria attack.

This thesis has aimed to obtain more information on the physiological processes that could explain the susceptibility of the common bean Riñón variety to Pph, focusing on the main role that cell wall remodeling, especially pectins, can have to obtain a solution that somehow activates the common bean immunity.

Our work hypotheses are that Pph inhibits the Riñón common bean immune system at some point during the infection, probably from the start, which triggers the disease. Knowing this inhibiting mechanism or finding the point of the defensive pathway that is blocked, it would be possible to find a solution to avoid it. On the other hand, if we are able to activate or reinforce the common bean defense system, it would be possible to reduce the effects of the disease or even avoid it completely. Furthermore, we believe that the cell wall may play a key role in pathogen defense and recognition. To address these studies, we have carried out a series of in vitro experiments in order to force the infection with the bacteria, avoiding interference with other stresses, and to be able to study what happens in the first moments of the infection both at a physiological and molecular level. In addition, experiments have been carried out to elicit the immune system of the common bean, both with chemical compounds such as INA, and with plant-based preparations (PBPs), and an analysis has been made of the changes that occur in the common bean cell wall after infection and/or elicitation of the plant. Consequently, 4 partial objectives were established, which constituted each of the chapters of this thesis.

Objective 1: to study the perception and first defensive responses that are activated in the common bean Riñón variety after Pph infection (chapter I). For this, some typical responses of PTI were analyzed, such as the ROS burst and the calcium influx, antioxidant activities, defense-related phytohormones, such as salicylic and abscisic acid, and the expression analysis of defense-related genes. In addition, 6 WAK receptors were identified in silico, whose expression was also evaluated. As a result, it was found that at least PvWAK1 increases its expression within minutes after infection, which could indicate a possible role in defense. In addition, there was an increase in total and apoplastic H2O2 and an increase in PR1 expression, but no activation of the antioxidant system and, above all, no SA peak was detected, which probably prevented HR activation. In our common bean variety, the lack of these defensive mechanisms led to an early cell damage and high susceptibility to Pph. The fact that PvWAK1 expression increased after Pph infection could indicate that the effectors of the bacteria did not inhibit the expression of this receptor, at least in early stages, and could be interesting to consider it for breeding or genetic engineering programs. Finally, this study also encourage to investigate whether the application of oligomers to activate defense responses in common bean Riñón variety through PvWAK receptors.

Objective 2: to find out if the immune system of this common bean variety could be activated prior to infection, and if this activation rendered, such as Pph inoculation, a remodeling of the cell wall (chapter II). For this, plants pretreated or not with a structural analog of SA, called INA, were inoculated or not with Pph, and an analysis of their cell walls and activation of the defense system through ROS release was performed. As a result, the activation of the immune system with INA produced a higher amount of ROS after incubation with flg22, and INA-treated plants were more resistant to Pph infection. Pph inoculation modified the cell wall, but to a lower extent than INA-priming. In general, the Pph infection did not modify the cellulose content, but it did increase that of pectins (homogalacturonan and rhamnogalacturonan I) in pectic fractions (CDTA and Carbonate), and that of hemicelluloses (arabinoxylans) in the fraction of hemicelluloses strongly bound to the cell wall (KII fraction). The molecular weight of the polysaccharides increased mainly in the carbonate fraction, but the cell wall was found to be as enzymatically hydrolysable as the cell wall extracted from control plants. In contrast, INA treatment produced a drastic remodeling of the extracted cell walls. The cellulose content increased, there was a displacement among the fractions, as well as an increase in the molecular weight of the extracted polysaccharides in each fraction. This could be related to an increase in both pectins and extensins in all fractions, which produced a greater crosslinking between polysaccharides, rendering a cell wall more resistant to enzymatic hydrolysis. The subsequent inoculation with Pph in INA-pretreated plants did not modify the cell walls with respect to those only INA-treated. In addition, the plants primed with INA showed less leave damage than mock plants after Pph inoculation.

Objective 3: to obtain information of the genes involved in the early response of common bean Riñón variety to Pph. For this, 15-day-old common bean plants were inoculated or not with Pph, and 2 or 9 hours after the infection, the RNA was extracted to perform a transcriptomic analysis by RNAseq (chapter III). At 2 hours post infection, an overexpression of defense-related genes was observed, but this increase was not sustained. This was also observed when defense-related phytohormones were quantified, such as salicylic, jasmonic and abscisic acids, and in the expression of cell wall related genes. The analysis of cell wall monosaccharides revealed an increase in the sugars content at 2 hours post-infection, but decreased again at 9 hours, except for GalA, which suggested an increase in pectin synthesis or a reduction in its degradation. This second option was confirmed by observing that most of the activities related to pectin degradation (PL, PG and PME) had decreased, while the expression of genes related to PME inhibitory enzymes (PMEIs) increased. This could be a protective strategy by the plant against the Pph pectin-degrading activities, as it has been observed in this work. Another possible strategy for protecting the integrity of the pectins, and therefore of the cell wall, could be the formation of egg-box complexes, as we have observed by immunohistochemistry. For the formation of these egg-box complexes, demethylation of pectins is necessary and although general PME activity decreased, some genes for PMEs, such as the Arabidopsis ortholog PvPME17, increased its expression. In addition, an explanation for the decreased of PME activity could be the overexpression of PMEIs. Among others, PvPMEI3, the Arabidopsis ortholog of PMEI3, was the most up-regulated. The functional analysis of this gene was evaluated in Arabidopsis pmei3 mutants, which showed susceptibility to Pph that Col-0 did not have. Finally, PvPMEI3 was shown to have PMEI activity, and it could play a key role in the resistance of common bean to Pph infection.

Finally, chapter IV was spent in screening plant-based preparations for their ability to inhibit the Pph growth, as well as testing whether any of them were capable of activating the plant immune system, evaluating some of the physiological parameters and defense-related molecular factors previously studied. In summary, 4 plant-based preparations were tested, of which 2 were the most effective (grapevine pomace and nettle) in inhibiting Pph growth. Only the treatment with nettle led to the activation of some defense mechanisms, such as redox signaling processes and increased expression levels of defense-related genes, especially PR1. The common bean plants treated with these products did not decrease their final production. The first in vitro tests also suggest that the application of nettle can protect the bean from infection with Pph. All these results suggest that plant-based preparations from Urtica dioica could be used in the near future to diminish the halo blight consequences.

To summarize, this thesis has deepened into the knowledge of interacting mechanisms of common bean Riñón variety-Pph pathosystem, showing some of the possible causes of susceptibility, such as the lack of SA-production shortly upon infection, which possibly prevents the common bean reinforcement of its cell wall and activates other defense mechanisms such as HR and SAR. In fact, we have shown that common bean can be elicited with a structural analog of SA, which leads to a strong cell wall reinforcement that makes the plant less susceptible to Pph and has a more reinforced cell wall with pectins and extensins, and therefore less enzymatically hydrolysable. The role of pectins in the defensive mechanisms has also been demonstrated through the transcriptome analysis that we have carried out in this work, which we have verified that some enzymes involved in the metabolism and modification of pectins play a crucial role in the defensive processes, such as PMEI3, whose mutation in Arabidopsis plants leads to the susceptibility to Pph. Finally, we have verified that the elicitation of the plant immune system is also possible through plant-based products, which opens a very interesting way for the development of ecological phytosanitary products that can be applied in field.