Alternativas y reducción del uso de antibióticos en el ganado porcino

Abstract

[ES] Tradicionalmente el mal uso de los de antibióticos como promotores de crecimiento, así como su abuso profiláctico y metafiláctico ha llevado a las bacterias resistentes frente a antibióticos a una posición muy crítica para la salud humana y la sanidad animal. Por ello, las autoridades correspondientes a nivel nacional e internacional han diseñado diversos planes de control y vigilancia de este fenómeno, reduciendo en gran medida el uso de antibióticos. Las explotaciones ganaderas, más concretamente las intensivas de porcino, han empezado a realizar la transición para lograr la disminución de uso de los antibióticos, y también para que estas medidas afecten lo menos posible en la salud de los cerdos y a en los índices de producción. Para un conocimiento adecuado de las resistencias frente a antibióticos es fundamental estudiar el perfil de resistencias del microorganismo. Por ello, el aislamiento, identificación y perfil de resistencia de los microorganismos es un aspecto clave como estrategia para el control y tratamientos adecuados. Por otro lado, la bioseguridad en las granjas es otro de los aspectos que se deberían tener en cuenta, puesto que cuanto mejor es la limpieza y desinfección más probabilidad existe de cortar los ciclos de contagios entre lotes. Además, un ambiente más limpio mejora la salud general de los animales, previniendo la propagación de los microorganismos patógenos. Por último, el uso de aditivos alimentarios como antimicrobianos y moduladores de la microbiota está cada vez más en auge, como medidas alternativas al uso de antibióticos. Por todo lo anterior, en la presente Tesis Doctoral se ha abordado este problema desde los diferentes perspectivas. La identificación de las especies bacterianas aisladas de muestras de origen respiratorio se realizó mediante PCR y MALDI-TOF, obteniendo 60 cepas de Streptococcus suis, 48 de Pasteurella multocida, 18 de Actinobacillus pleuropneumoniae, y 5 de Glaesserella parasuis También se estudió el perfil de resistencia a los antibióticos. Las resistencias de A. pleuropneumoniae y G. parasuis se estudiaron mediante antibiogramas de disco. A. pleuropneumoniae fue sobre todo resistente a trimetroprima-sulfametoxazol y eritromicina, con un 61,1 % de aislados resistentes en ambos casos. Para Glaesserella parasuis se obtuvieron resistencias sobre todo para tetraciclina y ampicilina, con un 60 % de los aislados. Por otro lado, S. suis y P multocida fueron estudiados mediante el método SensititreTM. Para P. multocida se obtuvieron resistencias mayoritariamente para las lincosamidas (en un 94,4 % de los casos resistentes a clinfamicina). Para las sulfaminas y tiamulina se obtuvo un 55,5 % de aislados resistentes, y para resto de los antibióticos probados se registró sensibilidad en al menos el 50 % de los aislados. Las proporciones más elevadas de resistencia entre los aislados de S. suis se observaron en las tetraciclinas con un 95 % y 93,3 % para la clortetraciclina y oxitetraciclina, respectivamente. Además, en el caso de las dos especies bacterianas más prevalentes se realizó el estudio de genes, tanto de resistencia frente a antibióticos como de factores de virulencia. Respecto a los factores de virulencia, S. suis presentó un 6,7 % de los aislados positivos frente al gen epf; un 58,3 % positivos para el gen mrp, un 43,3 % para el gen sly, un 76,7 % para el gen luxS y un 53,3 % para el gen gapd. El gen más encontrado en estos aislados fue el luxS, presente en un 76,6 % de los aislados. Estudiando a P. multocida observamos que el total de los aislados fue positivo para el gen oma87, (48 aislados). Los genes hgbA, nanH, ompH, ptfA y sodA lo fueron en el 95,8% seguidos por el gen tonB, con un 83,3 % de casos positivos. Los genes menos prevalentes fueron el toxA, con un 27,1% de los aislados, el pfhA, con un 10,4%, y por el tbpA, con únicamente un aislado positivo.

Respecto a los genes de resistencia frente a antibióticos analizados en S. suis, de los cuatro estudiados, para las tetraciclinas el gen tetO estuvo presente en un 68,3 % de las bacterias, frente al tetM, presente únicamente en el 1,7 %. Para el estudio de los genes de resistencia frente a los macrólidos ermB se encontró en un 46,7 % de los aislados, del total, MefA/E estuvo presente en un 8,3 de los aislados. Para las resistencias frente a tetraciclinas, un 12,5 % de aislados fueron positivos frente al gen tetA, y un 39,6 % para tetB. Para la resistencia frente a β-lactámicos, el 27,1 % de los aislados presentaron el gen blaROB1 frente al 8,3 % de los aislados con blaTEM. Respecto a los macrólidos presentaron una resistencia de en 16,7 % para el gen ermA, del 41,7 % para el ermC, del 22,9 % para el msrE y de 0 % para el mphE. En relación con el estudio de la acción de los desinfectantes, con el fin de mejorar la bioseguridad, se realizaron ensayos tanto in vitro como en granja, así como también se probaron nuevos métodos de desinfección, como la ozonización. Se analizó la capacidad de los desinfectantes más comunes en granja sobre bacterias ambientales y del CRP concluyendo que los desinfectantes polimorfo y limoseptic no funcionaron con la misma eficacia que los demás probados. También se realizaron pruebas in vitro con ozono y agua ozonizada. Existió una reducción del 100 % en el número de colonias en los 100 litros de aire a 1,5 ppm de ozono: por ello, para las bacterias presentes en el aire resultó muy eficaz. Para esta concentración de ozono y con agua ozonizada en objetos de superficie irregular, la desinfección funcionó igual que el desinfectante convencional en comederos, bebederos y paredes, y mejor en el caso de las placas calefactoras, suelos y juguetes. Este hallazgo fue de gran interés, puesto que el ozono es un desinfectante que no deja residuos, siendo mejor para el medio ambiente. Tampoco necesita aclarado, mejorando así los tiempos de secado, lo que agiliza el tiempo de llenado con el siguiente lotes de cerdos. Teniendo en cuenta el uso de aditivos alimentarios como alternativa al uso de antibióticos, se realizaron estudios in vitro para evaluar la capacidad antibacteriana del ácido láurico, en bacterias Gram positivas y Gram negativas, realizándose determinaciones de la concentración mínima inhibitoria (CMI) para las bacterias S. suis y P. multocida. En estos ensayos se incluyeron métodos basados en la difusión (tanto en placa como en disco) para cuantificar la inhibición de las bacterias frente a estos compuestos. También se realizó un estudio de microscopía electrónica de barrido para observar el efecto del ácido láurico frente a S. suis. Los ensayos de difusión en placa no se pudieron llevar a cabo debido a las características físico-químicas del ácido láurico con el medio de cultivo, obteniéndose placas muy heterogéneas. Por otro lado, los métodos de difusión por disco sí se pudieron llevar a cabo sin ningún problema, obteniendo muy buenos resultados para el ácido láurico y monolaurina en el caso de ambas bacterias estudiadas y en concentraciones intermedias. Se estudiaron concentraciones desde 2,4 hasta 1500 mg/ml de ácido láurico o monolaurina al 5 %, obteniendo la inhibición para todas las concentraciones de ácido láurico en S. suis, y para P. multocida a partir de 40 mg/ml se obtuvieron inhibiciones del crecimiento bacteriano. Además; en el caso de S. suis, se realizó un estudio de microscopía electrónica de barrido, en el que se se pudo observar una disminución de la densidad bacteriana y cambios en su morfología al ser expuesto a 900 mg/ml de ácido láurico. Por último, se valoró en un ensayo experimental en granja el efecto de suplementación de la dieta con dos dosis diferentes de ácido láurico. Esta experiencia se llevó a cabo en la etapa de transición, sobre 144 lechones destetados (25 días de edad), que se distribuyeron en tres grupos (dos corrales por grupo). Todos los grupos recibieron piensos sin antibióticos ni óxido de zinc. Los animales del primer grupo recibieron pienso pre-starter y starter sin aditivo, el segundo grupo recibió pienso suplementado con 2 kg de ácido láurico por tonelada y el último grupo suplementado a 4 kg/T. Los valores de ganancia media diaria (GMD) durante los 43 días del experimento fueron muy similares en los tres casos, aunque algo más elevados en el grupo que recibió la dosis más alta de ácido láurico. El consumo de pienso fue más elevado en el grupo control (28,64 kg/cerdo), en comparación con los grupos que recibieron ácido láurico (grupo de 2 kg/T: 27,17 kg/cerdo y grupo 4 kg/T: 27,48 kg/cerdo). Finalmente, el índice de conversión mostró una leve mejoría (más pienso convertido en kilo productivo) en el grupo que recibió 4 kg/T (2,02) frente al grupo control (2,29). Las diferencias no alcanzaron significación estadística.

Al estudiar la microbiota la riqueza de especies bacterianas fue más alta en el caso de la microbiota fecal, en comparación con la microbiota respiratoria, la cual fue incrementando su diversidad a lo largo del tiempo. El estudio de diversidad de especies se analizó mediante el índice de diversidad de Simpson, observando tanto las especies bacterianas en la microbiota como su abundancia relativa. En el caso de la microbiota fecal, este índice fue disminuyendo a lo largo del tiempo, por lo que se puede afirmar que las especies bacterianas fueron siendo más variadas a lo largo del tiempo. El índice de Simpson de la microbiota nasal fue aumentando a lo largo del tiempo, podemos decir que la diversidad de especies en este caso fue asentándose y disminuyendo a lo largo del tiempo. Para el análisis de los componentes principales del análisis de la microbiota nasal, se observó una segregación de las bacterias nasales en función de la edad de los cerdos, encontrando diferencias entre las especies. Respecto a la taxonomía fecal, se observó una segregación de las bacterias fecales, en función de la edad de los cerdos, entre el estadio final e inicial, pero no se observó diferencia clara entre el estadio intermedio y final.

Las especies de las bacterias más abundantes en la microbiota nasal fueron Clostridioides difficile, que apareció mayoritariamente durante los dos primeros muestreos a los cerdos y Bergeyella zoohelcum, la cual apareció sobre todo en el primer y último muestreo. Las bacterias que aparecieron durante todo el muestreo, pero sobre todo tras los 43 días que duró el ensayo, fueron S. suis y G. parasuis. Por último, fueron identificados varios integrantes del género Prevotella y Moraxella durante todo el ensayo.

Por otro lado, tras el análisis de la microbiota fecal obtuvimos diversos integrantes del género Prevotella, sobre todo en los lechones que llevaban consumiendo el pienso suplementado, tras los 14 días iniciales del experimento. La bacteria E. coli apareció en gran cantidad, sobre sobre todo al principio del experimento, por lo que luego podría haber sido desplazada por Prevotella. También se ha encontrado a Ruminococcus en cantidades destacadas, sobre todo en los lechones alimentados con la máxima dosis de ácido láurico. El género Clostridium fue variando a lo largo de tiempo, así como la especie Bacteroides frágilis.

[EN] Traditionally, the misuse of antibiotics as growth promoters, as well as their prophylactic and metaphylactic abuse, has brought antibiotic resistant bacteria to a very critical position for human and animal health. Therefore, the relevant authorities at national and international level have designed various control and surveillance plans for this phenomenon, greatly reducing the use of antibiotics. Livestock farms, more specifically intensive pig farms, have started to make the transition to achieve a decrease in the use of antibiotics, and to ensure that these measures have as little impact as possible on the health of pigs and on production rates. For a proper understanding of antibiotic resistance, it is essential to study the resistance profile of the micro-organism. Therefore, isolation, identification and resistance profile of microorganisms is a key aspect as a strategy for control and appropriate treatment. On the other hand, biosecurity on farms is another aspect that should be considered, since the better the cleaning and disinfection, the more likely it is to cut the cycles of contagion between batches. In addition, a cleaner environment improves the overall health of the animals, preventing the spread of pathogenic micro-organisms. Finally, the use of feed additives as antimicrobials and microbiota modulators is becoming increasingly popular as alternative measures to the use of antibiotics. For all of the above reasons, this Doctoral Thesis has approached this problem from different perspectives.

The identification of the bacterial species isolated from samples of respiratory origin was carried out by PCR and MALDI-TOF, obtaining 60 strains of Streptococcus suis, 48 of Pasteurella multocida, 18 of Actinobacillus pleuropneumoniae, and 5 of Glaesserella parasuis.

The antibiotic resistance profile was also studied. Resistance of A. pleuropneumoniae and G. parasuis was studied by disc antibiograms. A. pleuropneumoniae was mostly resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole and erythromycin, with 61.1 % of isolates resistant in both cases. For Glaesserella parasuis, resistance was mainly to tetracycline and ampicillin, with 60 % of the isolates.

On the other hand, S. suis and P multocida were studied using the Sensititre methodTM. For P. multocida, resistance was obtained mainly for lincosamides (94.4 % of cases resistant to clinfamycin). For sulphamines and tiamulin, 55.5 % of isolates were resistant, and for all other antibiotics tested, at least 50 % of the isolates were found to be susceptible. The highest proportions of resistance among S. suis isolates were observed for tetracyclines with 95 % and 93,3 % for chlortetracycline and oxytetracycline, respectively.

In addition, in the case of the two most prevalent bacterial species, the study of genes for both antibiotic resistance and virulence factors was carried out. Regarding virulence factors, S. suis presented 6.7 % of the isolates positive for the epf gene, 58.3 % positive for the mrp gene, 43.3 % for the sly gene, 76.7 % for the luxS gene and 53.3 % for the gapd gene. The most frequently found gene in these isolates was luxS, present in 76.6 % of the isolates. When studying P. multocida, we observed that all the isolates were positive for the oma87 gene (48 isolates). The hgbA, nanH, ompH, ptfA and sodA genes were positive in 95.8 %, followed by the tonB gene, with 83.3 % of positive cases. The least prevalent genes were toxA, with 27.1% of isolates, pfhA, with 10.4%, and tbpA, with only one positive isolate.

Regarding the antibiotic resistance genes analysed in S. suis, of the four genes studied, for tetracyclines the tetO gene was present in 68.3 % of the bacteria, compared with tetM, which was present in only 1.7 %. For the study of macrolide resistance genes ermB was found in 46.7 % of the isolates, MefA/E was present in 8.3 % of the isolates. For tetracycline resistance, 12.5 % of isolates were positive for the tetA gene, and 39.6 % for tetB. For resistance to β-lactams, 27.1 % of isolates were positive for the bla geneROB1 compared to 8.3 % of isolates with blaTEM . Macrolide resistance was 16.7 % for the ermA gene, 41.7 % for ermC, 22.9 % for msrE and 0 % for mphE.

In relation to the study of the action of disinfectants, in order to improve biosecurity, both in vitro and on-farm tests were carried out, as well as new disinfection methods, such as ozonisation, were tested. The capacity of the most common on-farm disinfectants on environmental and PRC bacteria was analysed and it was concluded that “polimorfo” and “limoseptic” disinfectants did not work as effectively as the others tested. In vitro tests were also carried out with ozone and ozonised water. There was a 100 % reduction in the number of colonies in the 100 litres of air at 1.5 ppm ozone: for bacteria in the air it was therefore very effective. For this ozone concentration and with ozonized water on objects with uneven surfaces, disinfection worked as well as conventional disinfectant on feeders, drinkers and walls, and better for heating plates, floors and toys. This finding was of great interest, as ozone is a disinfectant that does not leave residues, which is better for the environment. It also does not need rinsing, thus improving drying times, which speeds up the filling time with the next batch of pigs.

Considering the use of food additives as an alternative to the use of antibiotics, in vitro studies were carried out to evaluate the antibacterial capacity of lauric acid in Gram-positive and Gram-negative bacteria, determining the minimum inhibitory concentration (MIC) for S. suis and P. multocida bacteria. These assays included diffusion-based methods (both plate and disc) to quantify the inhibition of bacteria against these compounds. A scanning electron microscopy study was also performed to observe the effect of lauric acid against S. suis.

Plate diffusion tests could not be carried out due to the physicochemical characteristics of lauric acid with the culture medium, obtaining very heterogeneous plates. On the other hand, the disc diffusion methods could be carried out without any problem, obtaining very good results for lauric acid and monolaurin in the case of both bacteria studied and at intermediate concentrations. Concentrations from 2.4 to 1500 mg/ml of lauric acid or 5 % monolaurin were studied, obtaining inhibition for all concentrations of lauric acid in S. suis, and for P. multocida inhibition of bacterial growth was obtained from 40 mg/ml onwards. In addition, in the case of S. suis, a scanning electron microscopy study was carried out, in which a decrease in bacterial density and changes in morphology were observed when exposed to 900 mg/ml lauric acid.

Finally, the effect of supplementing the diet with two different doses of lauric acid was evaluated in an on-farm experimental trial. This experiment was carried out in the transition stage, on 144 weaned piglets (25 days of age), which were distributed in three groups (two pens per group). All groups received feed without antibiotics and zinc oxide. The animals in the first group received pre-starter and starter feed without additives, the second group received feed supplemented with 2 kg lauric acid per tonne and the last group supplemented at 4 kg/T. The average daily gain (ADG) values during the 43 days of the experiment were very similar in all three cases, although somewhat higher in the group receiving the higher lauric acid dose. Feed intake was higher in the control group (28.64 kg/pig) compared to the groups receiving lauric acid (2 kg/T group: 27.17 kg/pig and 4 kg/T group: 27.48 kg/pig). Finally, the feed conversion ratio showed a slight improvement (more feed converted into productive kg) in the group receiving 4 kg/T (2.02) compared to the control group (2.29). The differences did not reach statistical significance.

When studying the microbiota, the richness of bacterial species was higher in the case of the faecal microbiota, compared to the respiratory microbiota, which increased in diversity over time. The species diversity study was analysed using Simpson's diversity index, looking at both the bacterial species in the microbiota and their relative abundance. In the case of the faecal microbiota, this index decreased over time, so it can be affirmed that the bacterial species became more varied over time. Simpson's index of the nasal microbiota increased over time, so we can say that the diversity of species in this case settled and decreased over time. For the principal component analysis of the nasal microbiota analysis, we observed a segregation of nasal bacteria according to the age of the pigs, finding differences between species. Regarding faecal taxonomy, a segregation of faecal bacteria was observed, depending on the age of the pigs, between the final and initial stage, but no clear difference was observed between the intermediate and final stage.

The most abundant bacterial species in the nasal microbiota were Clostridioides difficile, which appeared mostly during the first two samplings of the pigs, and Bergeyella zoohelcum, which appeared mostly in the first and last sampling. Bacteria occurring throughout the sampling, but especially after the 43 days of the trial, were S. suis and G. parasuis. Finally, several members of the genera Prevotella and Moraxella were identified throughout the trial.

On the other hand, after analysis of the faecal microbiota, we obtained several members of the Prevotella genus, especially in the piglets that had been consuming the supplemented feed after the initial 14 days of the experiment. E. coli bacteria appeared in large numbers, especially at the beginning of the experiment, and could have been displaced by Prevotella. Ruminococcus was also found in high numbers, especially in piglets fed the highest dose of lauric acid. The genus Clostridium varied over time, as did the species Bacteroides fragilis.