Compartir
Título
Evaluación de la liberación de endotoxinas bacterianas inducida por antibióticos utilizados en el tratamiento de mamitis en ganado bovino
Autor
Director/es
Facultad/Centro
Área de conocimiento
Cita Bibliográfica
Flórez Magadán, P. (2024). Evaluación de la liberación de endotoxinas bacterianas inducida por antibióticos utilizados en el tratamiento de mamitis en ganado bovino. [Tesis doctoral, Universidad de León]
Fecha
2024-03-21
Resumen
[ES] La mamitis es una de las enfermedades más comunes en el ganado lechero y causa
de importantes pérdidas económicas en el sector lácteo en todo el mundo, así como de
efectos negativos sobre el bienestar animal. Se caracteriza por una reacción inflamatoria
de la glándula mamaria que produce cambios significativos en la composición bioquímica
de la leche, estando asociada principalmente a infecciones por bacterias, tanto Gram
negativas como positivas. La liberación de endotoxinas asociada a la lisis bacteriana es
un factor relevante en el curso clínico de la mamitis causada por bacterias Gram negativas
y debe tenerse en cuenta en el manejo clínico de estas infecciones empleando antibióticos.
Es por ello que la detección de endotoxinas en muestras de leche puede ser una
herramienta de gran utilidad en la gestión de la mamitis en las explotaciones lecheras. De
forma similar, el estudio de la cinética de inhibición de diferentes bacterias patógenas y
de la cinética de liberación de endotoxinas tras la exposición a diferentes antibióticos
puede proporcionar información de interés para el manejo clínico de esta importante
enfermedad.
En esta Tesis Doctoral hemos optimizado un ensayo turbidimétrico cinético
basado en lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para la cuantificación de endotoxinas
en muestras de leche, introduciendo en el procedimiento un pretratamiento de estas
muestras mediante filtración a través de un filtro de polivinilo y dilución con el fin de
minimizar las interferencias asociadas a esta compleja matriz. En una segunda etapa,
hemos investigado, empleando esta técnica el efecto de algunos antibióticos empleados
de forma habitual en el tratamiento de mamitis sobre el crecimiento bacteriano y la
liberación de endotoxinas, empleando un sistema de cultivo en leche o cultivos mini-ubre
que trata de reproducir las condiciones de la infección en la glándula mamaria.
La técnica de detección y cuantificación de endotoxinas optimizada fue validada
siguiendo las indicaciones establecidas por las normas de la Organización Internacional
de Normalización, empleándose para la determinación en muestras de leche procedentes
de animales con mamitis clínica asociada a bacterias tanto Gram negativas como
positivas, en muestras de leche de tanque y en leches comerciales. Nuestros resultados
demuestran la robustez y utilidad de este ensayo para la cuantificación de endotoxinas en
un amplio rango de concentraciones, permitiendo identificar mamitis por coliformes en
muestras de leche de animales con enfermedad clínica de la glándula mamaria, así como
detectar endotoxinas en muestras de leche de tanque o incluso en algunas leches
comerciales UHT (tratamiento a altas temperaturas).
El modelo experimental optimizado de cultivo en leche o cultivos mini-ubre
permitió simular las condiciones de una infección intramamaria con dos especies de
bacterias Gram negativas, previamente aisladas de leches de animales con mamitis,
Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, y valorar el efecto de la exposición a cuatro
antibióticos de uso habitual en el manejo de mamitis clínicas en ganado vacuno:
bencilpenicilina, dihidroestreptomicina, cefalosporina y cefapirina. Se determinaron las
cinéticas de inhibición de crecimiento y de liberación de endotoxinas en estos cultivos,
comparándolas con las obtenidas en controles con idénticas condiciones, pero sin
tratamiento antibiótico. Todos los antibióticos valorados, tal y como era de esperar,
provocaron una reducción del crecimiento, más acentuado a partir de las 3-4 horas de
exposición, aunque con diferencias en las cinéticas de inhibición en función del modo de
acción. Además, todos los antibióticos generaron una liberación de endotoxinas en
comparación con los controles que también varió en función del antibiótico. Así, la
exposición a cefalosporinas se asoció a una muerte bacteriana más lenta y, al mismo
tiempo, a una mayor liberación de endotoxinas, probablemente a consecuencia de
fenómenos de filamentación bacteriana por cambios en la morfología de la membrana
celular de las bacterias. Por el contrario, el tratamiento con dihidroestreptomicina
combinó una rápida actividad bactericida con una liberación más reducida de
endotoxinas, probablemente a consecuencia de una lisis celular rápida. [EN] Mastitis is one of the most common diseases in dairy cattle and causes significant
economic losses in the dairy industry worldwide, as well as negative effects on animal
welfare. It is characterized by an inflammatory reaction of the mammary gland that
produces significant changes in the biochemical composition of milk, being associated
with infections by both Gram-negative and Gram-positive bacteria. The release of
endotoxins associated with bacterial lysis is a key factor in the clinical course of mastitis
caused by Gram-negative bacteria and should be taken into consideration when using
antibiotics in the management of these infections. Therefore, the detection of endotoxins
in milk samples would be of great interest in the management of bovine mastitis.
Similarly, the study of the inhibition kinetics of different pathogenic bacteria as well as
endotoxin release kinetics after exposure to different antibiotics would provide relevant
information for the clinical approach of this important disease.
In this PhD thesis we have optimized a kinetic turbidimetric assay based on
Limulus amebocyte lysate (LAL) for the quantification of endotoxins in milk samples,
introducing into the procedure a pre-treatment by filtration through a polyvinyl filter and
dilution in order to minimize the interferences associated with this complex matrix. In a
second stage, we have investigated, using this technique, the effect of some antibiotics
commonly used in the treatment of bovine mastitis on bacterial growth and endotoxins
release, using a milk culture system or mini-udder cultures which reproduce the
conditions of the infection of the mammary gland.
The optimized endotoxin detection and quantification assay was validated
following the indications established by the standards of the International Organization
for Standardization and was used for the determination in milk samples from animals with
clinical mastitis associated with both Gram-negative and Gram-positive bacteria, in bulk
milk and in commercial UHT (ultra high temperature) treated milk. Our results
demonstrate the robustness and usefulness of this assay for the quantification of
endotoxins in a wide range of concentrations, allowing the identification of coliform
mastitis in milk samples from animals with clinical mammary gland disease, as well as
detecting endotoxins in bulk milk or even in some commercial milks.
The experimental model or mini-udder cultures allow the reenactment of the
conditions of an intramammary infection with two species of Gram-negative bacteria,
previously isolated from the milk of cows with mastitis, Escherichia coli and
Enterobacter aerogenes, and to assess the effect of the exposition to four antibiotics
commonly used in the management of clinical mastitis in cattle: benzylpenicillin,
dihydrostreptomycin, cephalosporin and cephapirin. The kinetics of growth inhibition
and endotoxin release were investigated in these cultures and compared with the kinetics
determined in controls with identical conditions, but without antibiotic treatment. As
expected, all antibiotics tested caused a significant reduction in growth, more pronounced
after 3-4 hours of exposure, with differences in these inhibition kinetics depending on
each antibiotic and its mode of action. Furthermore, all antibiotics produced a release of
endotoxins compared to the controls which also varied depending on the antibiotic. Thus,
exposure to cephalosporins was associated with a slower bacterial death and, at the same
time, a greater release of endotoxins, probably as a result of bacterial filamentation
phenomena due to changes in the morphology of the bacterial cell membrane. In contrast,
dihydrostreptomycin combined a quick bactericidal activity with a reduced release of
endotoxin, probably as a result of rapid cell lysis.
Materia
Palabras clave
URI
DOI
Aparece en las colecciones
- Tesis [1353]
Ficheros en el ítem
Tamaño:
4.414
xmlui.dri2xhtml.METS-1.0.size-megabytes
Formato:
Adobe PDF