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Título
Estrategias de mejora de la inseminación artificial ovina: una perspectiva seminal
Autor
Director/es
Facultad/Centro
Área de conocimiento
Cita Bibliográfica
Neilo Montero, M. (2024). Estrategias de mejora de la inseminación artificial ovina: una perspectiva seminal. [Tesis doctoral, Universidad de León]
Fecha
2024-04-15
Resumen
[ES] La optimización de la inseminación artificial (AI) en la especie ovina es fundamental para aumentar su implementación, incrementando así los rendimientos productivos y la mejora genética en esta ganadería. En la presente Tesis Doctoral se analizan diferentes estrategias en este sentido, recogidas en un total de cinco artículos científicos.
Los dos primeros trabajos se centraron en definir las condiciones ideales para centrifugar el semen de carnero, teniendo en cuenta que el daño producido por este procedimiento sobre los espermatozoides es específico de cada especie. En la Publicación I se evaluó el rendimiento de tres fuerzas centrífugas (600, 3.000 y 6.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente) y sus efectos sobre la motilidad y funcionalidad de los espermatozoides. Fuerzas de centrifugación iguales o superiores a 3.000 x g indujeron daños en la calidad espermática a ambos niveles, y a 600 x g no se logró una buena compactación celular. Por ello, en la primera experiencia de la Publicación II se valoró el efecto de dos modelos de refrigeración a 15 °C (rápida o lenta) y dos diluyentes (INRA 96® y Tyrode’s) sobre la tasa de recuperación, el peso del pellet y la calidad espermática tras la centrifugación del semen a 600 x g durante 10 minutos. El INRA 96® combinado con la refrigeración lenta y el Tyrode’s a temperatura ambiente registraron los mejores resultados. En un segundo paso se evaluó la influencia de tres fuerzas centrífugas (600, 1.200 y 6.000 x g durante 10 minutos) sobre los mismos parámetros con INRA 96® y Tyrode’s en las condiciones seleccionadas previamente. La mayor eficacia cuantitativa y cualitativa se logró a 1.200 x g en ambos medios de dilución, ya que a 6.000 x g se observaron alteraciones de la motilidad de los espermatozoides. Por último, para comprobar los efectos in vivo del protocolo de centrifugación se realizó una prueba de fertilidad con semen centrifugado y almacenado a 15 °C durante 6 horas. El daño producido por 6.000 x g sobre la motilidad espermática se mantuvo hasta las 6 horas, observándose además una disminución en la fertilidad tras la AI cervical. Este hecho confirmó la idoneidad del protocolo de centrifugación a 1.200 x g durante 10 minutos (en INRA 96® y a 15 °C).
En la Publicación III, en vista de la escasa y contradictoria información existente en relación a la retirada de plasma seminal (SP) como parte de los protocolos de refrigeración del semen de carnero, se investigó el papel del mismo en la conservación seminal a medio plazo en forma líquida (hasta 48 horas a 5 °C). Para ello, en un primer paso se valoró el efecto de la adición de SP a espermatozoides epididimarios de carnero al inicio o al final de dicho protocolo de conservación, y se analizaron la motilidad y funcionalidad espermática tras 6 horas a 15 °C y 24 y 48 horas a 5 °C. Los espermatozoides mostraron una mayor calidad a las 48 horas cuando se conservaron en ausencia de SP, aunque una suplementación final con SP dio lugar a una mejora de la motilidad y funcionalidad espermáticas. Además, en una segunda experiencia se evaluó el efecto de la eliminación de SP en muestras seminales de carnero recién eyaculadas utilizando el protocolo de centrifugación previamente optimizado y en las mismas condiciones de almacenamiento. La retirada de SP disminuyó la funcionalidad de los espermatozoides tras 24 y 48 horas a 5 °C, mientras que la suplementación final tuvo efectos positivos sobre la calidad y fertilidad en AI cervical. Aunque la ausencia de SP resultó ser beneficiosa en un protocolo de conservación a medio plazo en forma líquida en un modelo espermático sin contacto previo con esta sustancia (espermatozoides epididimarios), la no constatación de este hecho en muestras seminales eyaculadas sometidas al mismo protocolo de conservación indica la posible ineficiencia del método de retirada de SP.
Los dos últimos artículos tuvieron como objetivo optimizar la evaluación de la calidad espermática en el carnero, ya que la selección de machos y eyaculados con buen potencial fecundante para su uso en la AI ovina es fundamental. En este sentido, la Publicación IV se centró en determinar el mejor momento para llevar a cabo dicha evaluación dentro de un protocolo de conservación a 15 °C durante 6 horas. Se determinaron la motilidad y funcionalidad espermáticas a 0 horas (30 °C), 3 y 6 horas (15 °C), y 24 horas (5 °C) como control positivo de daño, y se observó que ambas mejoraban a las 6 horas. Complementariamente, se investigó el factor responsable de la inestabilidad de los espermatozoides durante las primeras horas de almacenamiento líquido testando las interacciones de espermatozoides epididimarios con el SP y el diluyente (independientemente y en combinación) en las mismas condiciones de almacenamiento que en la experiencia anterior. Los espermatozoides de los grupos con diluyente mostraron una motilidad y funcionalidad alteradas a las 0 horas, indicando que la adición del mismo actúa en un primer momento como factor desestabilizante, siendo necesarias de 3 a 6 horas de adaptación al diluyente antes de poder realizar una evaluación precisa de la calidad espermática. Finalmente, en la Publicación V, cuando se intentaron identificar algunos de los factores relativos al macho implicados en las diferentes tasas de fertilidad observadas tras la AI cervical en dos momentos de la época reproductiva (inicio y final), no se encontraron diferencias en la evaluación ultrasonográfica del complejo testicular de los carneros ni en la calidad espermática tras 6 horas a 15 °C. En cambio, un análisis del proteoma espermático detectó una menor expresión de proteínas relacionadas con el metabolismo energético, las interacciones espermatozoide-ovocito y la estructura del flagelo en el momento de la época reproductiva con menor fertilidad.
De forma global, los resultados de esta Tesis Doctoral demuestran la necesidad de optimizar los protocolos de manejo, conservación y análisis de calidad seminal en el carnero para diseñar estrategias realmente eficaces en la mejora de la AI ovina. [EN] The optimization of artificial insemination (AI) in the ovine species is crucial to increase its implementation, maximizing production performance and genetic gain in this farming. Different strategies are analyzed in this sense in the following Doctoral Thesis, compiled into a total of five scientific articles.
The first two papers focused on defining the ideal conditions for centrifuging ram semen, considering that sperm damage caused by this procedure is species-specific. Publication I evaluated the performance of three centrifugal forces (600, 3,000 and 6,000 x g for 10 minutes at room temperature) and their effects on sperm motility and functionality. Centrifugation forces equal to or greater than 3,000 x g induced a deleterious effect in sperm quality at both levels, and 600 x g not provide a successful cell packaging. Therefore, the first trial of Publication II assessed the effect of two cooling methods at 15 °C (fast or slow) and two diluents (INRA 96® y Tyrode’s) on sperm recovery rate, pellet weight and sperm quality after centrifugation of semen at 600 x g for 10 minutes. INRA 96® combined with slow refrigeration and Tyrode’s at room temperature registered the best results. In a second step, the influence of three centrifugal forces (600, 1,200 and 6,000 x g for 10 minutes) on the same parameters was evaluated with INRA 96® and Tyrode’s under the previously selected conditions. The highest quantitative and qualitative efficiency was achieved at 1,200 x g in both extenders, since 6,000 x g impaired sperm motility. Finally, to test the in vivo effects of the centrifugation protocol, a fertility trial was performed using semen centrifuged and stored at 15 °C for 6 hours. The damage produced by 6,000 x g on sperm motility was maintained until 6 hours, and a decrease in fertility after cervical AI was also observed. This confirmed the suitability of the centrifugation protocol at 1,200 x g for 10 minutes (in INRA 96® and at 15 °C).
In Publication III, because of the scarce and conflicting information on seminal plasma (SP) withdrawal as part of ram semen refrigeration protocols, the role of SP in medium-term semen preservation in liquid form (up to 48 hours at 5 °C) was investigated. To this end, the effect of SP addition to ram epididymal sperm at the beginning or at the end of the preservation protocol was assessed in a first step, and sperm motility and functionality were analyzed after 6 hours at 15 °C, and 24 and 48 hours at 5 °C. Sperm showed higher quality at 48 hours when stored in the absence of SP, while a final SP supplementation resulted in improved sperm motility and functionality. In addition, the effect of SP removal from freshly ejaculated ram seminal samples using the previously optimized centrifugation protocol was evaluated under the same storage conditions in a second experience. The removal of SP decreased sperm functionality after 24 and 48 hours at 5 °C, while the final supplementation had positive effects on quality and fertility in cervical AI. Although SP absence proved to be beneficial in a medium-term liquid preservation protocol in a sperm model without previous contact with this substance (epididymal sperm), the lack of this finding in ejaculated seminal samples under the same preservation protocol indicates the possible failure of the SP removal method.
The last two articles aimed to optimize sperm quality evaluation in rams, as the selection of males and ejaculates with good fertilizing potential is essential for use in ovine AI. In this regard, Publication IV focused on determining the best time to conduct this assessment within a preservation protocol at 15 °C for 6 hours. Sperm motility and functionality were determined at 0 hours (30 °C), 3 and 6 hours (15 °C), and 24 hours (5 °C) as a positive damage control, and both were found to improve at 6 hours. Additionally, the responsible factor of the sperm instability during the first hours of liquid storage was investigated testing the interactions of epididymal sperm with SP and extender (independently and in combination) under the same storage conditions used in the previous experience. Sperm from groups with diluent showed altered motility and functionality at 0 hours, indicating that extender addition initially acts as a destabilizing factor, requiring 3 to 6 hours of adaptation to the extender before an accurate assessment of sperm quality. Finally, in Publication V, when trying to identify some male factors involved in the different fertility rates obtained after cervical AI at two times of the breeding season (early and late), no differences were found in the ultrasonographic evaluation of ram testicular complex nor in the sperm quality after 6 hours at 15 °C. In contrast, a sperm proteome analysis detected a lower expression of proteins related to energy metabolism, sperm-oocyte interactions, and flagellum structure at the time of the reproductive season with lower fertility.
Overall, the results of this Doctoral Thesis demonstrated the importance of optimizing protocols for ram semen handling, preservation and quality analysis in order to design really effective strategies to improve sheep AI.
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ID proyecto
- info:eu-repo/grantAgreement/AEI/ Programa Estatal de I+D+i Orientada a los Retos de la Sociedad/ AGL2017-83098-R/ES/ ESTRATEGIAS PARA MEJORAR LA EFICACIA EN LA INSEMINACION ARTIFICIAL OVINA
- info:eu-repo/grantAgreement/AEI/ Programa Estatal para Impulsar la Investigación Científico-Técnica y su Transferencia/ PID2021-122470OB-I00/ES/ NUEVAS TECNOLOGIAS APLICADAS A LA INTERPRETACION PRACTICA DE LOS DEFICITS FUNCIONALES DEL ESPERMATOZOIDE DE CARNERO DURANTE LA CONSERVACION LIQUIDA A 5ºC HASTA 72H
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- Tesis [1364]
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