Control de las tricostrongilidosis ovinas: diseño, síntesis y ensayos clínicos de eficacia de nuevas moléculas de acción antihelmíntica

Abstract

[ES] Las infecciones producidas por parásitos helmintos, incluyendo nematodos, trematodos y cestodos, representan una importante causa de enfermedad y pérdida económica para la industria ganadera de pequeños rumiantes a nivel mundial. Dentro de los helmintos, los nematodos gastrointestinales son los más relevantes en términos de impacto sanitario y económico, tanto en países en desarrollo como en industrializados. En pequeños rumiantes, las especies responsables de producir las mayores pérdidas económicas son Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta y Trichostrongylus spp.

En condiciones de campo, la mayoría de las infecciones suelen ser mixtas, incluyendo diferentes especies de nematodos que se localizan en el abomaso e intestino. Se trata de procesos generalmente endémicos, de curso crónico y mortalidad baja. Sin embargo, el impacto de este tipo de parasitaciones en el animal va a depender no solo de la intensidad de la infección, si no también del estado fisiológico e inmunológico del hospedador. Los signos clínicos que suelen presentarse más comúnmente incluyen anorexia, diarrea, emaciación y anemia. Aunque, en casos de altos niveles de parasitación, sobre todo en animales jóvenes, se puede incluso producir la muerte.

La administración de fármacos antihelmínticos ha sido el tratamiento de elección para el control de estas parasitosis durante muchos años debido a la disponibilidad de fármacos de alta eficacia y seguridad. Sin embargo, el creciente aumento de la prevalencia de la resistencia a los antihelmínticos a nivel mundial hace que los actuales programas de control sean costosos e insostenibles a largo plazo.

Además hay que tener en cuenta que el cambio climático está provocando cambios en la incidencia e intensidad de estas infecciones, lo que agrava su impacto económico en la ganadería. Es por ello que la búsqueda de nuevos fármacos con actividad antihelmíntica y nuevos mecanismos de acción es de vital importancia en la actualidad.

Para abordar esta problemática, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral se enfoca en la búsqueda de nuevos compuestos con posible actividad antihelmíntica frente a las infecciones ovinas causadas por tricostrongílidos que puedan ayudar a resolver los problemas generados por la aparición de la resistencia.

En este contexto, tres de los cinco capítulos en que se divide la presente Tesis Doctoral se centran en la evaluación de la posible actividad antihelmíntica de varias familias de compuestos sintetizados por el departamento de Química Farmacéutica de la Universidad de Salamanca. En primer lugar, los compuestos fueron sometidos a un cribado primario a una dosis de 50 μM para determinar su eficacia in vitro frente a distintos estadios parasitarios del nematodo T. circumcincta. Los compuestos con una eficacia superior al 90% fueron seleccionados para llevar a cabo estudios con una cepa resistente a los bencimidazoles, ivermectina y levamisol, así como para calcular la dosis eficaz 50 (DE50) de cada uno de ellos.

Paralelamente se llevaron a cabo estudios in vitro de citotoxicidad para descartar aquellos más tóxicos. Los tres compuestos con mayor actividad antihelmíntica y menor toxicidad in vitro fueron seleccionados con el fin de continuar con los experimentos de toxicidad y eficacia en modelos animales. Dos derivados de diamina y un derivado bencimidazólico fueron los compuestos seleccionados como candidatos, todos ellos con una DE50 inferior a 3 μM en alguno de los ensayos llevados cabo. Una vez que se descartaron los posibles efectos adversos de la administración por vía oral de los tres candidatos en ratones, se evaluó su eficacia antihelmíntica utilizando para ello jerbos de Mongolia (Meriones unguiculatus) infectados con H.

contortus. Tras observar una reducción del 95% en el número de pre-adultos presentes en el estómago de los animales del grupo tratado con el derivado bencimidazólico a una dosis de 200 mg/kg, se decidió probar la eficacia del compuesto en el hospedador definitivo, la oveja.

En el último experimento de esta parte del trabajo se comprobó que el grupo de ovejas tratado con el derivado bencimidazólico a una dosis de 120 mg/kg, produjo una reducción del recuento de huevos en heces del 99% y del 95% en el número de adultos presentes en el abomaso, demostrando ser un candidato interesante para su desarrollo como fármaco antihelmíntico. Es por ello por lo que creemos necesario continuar realizando más estudios en futuro que permitan establecer una dosis mínima eficaz, así como determinar su eficacia en diferentes especies y cepas de nematodos gastrointestinales, y llevar a cabo estudios detallados de farmacocinética y farmacodinamia.

En este contexto, durante la estancia internacional llevada a cabo en el “Swiss Tropical and Public Health Institute”, en Basilea (Suiza), parte de los compuestos utilizados en el cribado llevado a cabo en el nematodo T. circumcincta fueron evaluados en otro modelo de nematodo gastrointestinal que infecta ratones, Trichuris muris. De nuevo, tres compuestos fueron seleccionados por su potente actividad frente a larvas de primer estadio en un cribado inicial a una dosis de 100 μM, para posteriormente comprobar su eficacia frente a las formas adultas del parásito. Los tres candidatos consistían en dos derivados bencimidazólicos y un derivado de aminoalcohol, siendo distintos de los seleccionados en el estudio anterior.

Adicionalmente, estos candidatos se testaron frente a las formas adultas del nematodo Heligmosomoides polygyrus. Como resultado final, dos de ellos mostraron eficacia en alguna de las dos formas adultas de los parásitos; uno de los derivados bencimidazólicos presentó una DE50 8,1 μM frente a T. muris y el el otro una DE50 de 5,3 μM frente a H. polygyrus. Es por ello que ambos compuestos podrían ser también potenciales candidatos para llevar a cabo ensayos de eficacia in vivo en un futuro utilizando animales infectados.

Con la finalidad de combatir el problema de la falta de nuevos fármacos antihelmínticos, en la presente Tesis Doctoral se ha abordado otro enfoque relacionado con la búsqueda de técnicas de cribado mejoradas que permitan la evaluación de gran cantidad de compuestos en un corto periodo de tiempo. Así, durante la segunda estancia internacional realizada en el “Laboratory of Growth Regulators” de la Universidad de Palacký, en Olomouc (República Checa), se puso a punto un protocolo de cribado de compuestos de alto rendimiento utilizando el dispositivo wMicrotracker ONE, en T. circumcincta y H. contortus. Este dispositivo es capaz de medir de forma automatizada la movilidad de las distintas formas parasitarias tras la incubación con los compuestos a través de microhaces de luz infrarroja.

Complementariamente, también hemos llevado a cabo estudios sobre el nivel de resistencia de los tricostrongílidos presente en los rebaños de ovino de la Comunidad Autónoma de Castilla y León frente a los fármacos bencimidazólicos mediante técnicas in vivo, in vitro y moleculares. Nuestro estudio confirmó un aumento de la presencia de resistencia antihelmíntica con respecto a los últimos datos analizados años anteriores, siendo T. circumcincta la especie más resistente. En este estudio el 35% de las explotaciones muestreadas resultaron resistentes al netobimín mediante el ensayo in vivo de reducción del número de huevos en heces y del 26% mediante el ensayo in vitro de eclosión de huevos, encontrándose una correlación muy alta entre ambas técnicas (r= -0.770; p < 0,0001). A nivel molecular, asociamos la presencia de un nuevo polimorfismo localizado en el codón 198 del gen que codifica para el isotipo 1 de la β-tubulina de T. circumcincta (E198L), con el nivel de resistencia de los bencimidazoles. En este sentido, se demostró una correlación muy alta y similar entre la presencia del nuevo polimorfismo y la resistencia medida mediante los ensayos in vivo e in vitro (r > 0,720; p < 0,0001).

[EN] Infections caused by helminth parasites, including nematodes, trematodes and cestodes, represent an important cause of disease and economic loss for the small ruminant livestock industry. Within helminths, gastrointestinal nematodes are the most relevant in terms of health and economic impact in both developing and industrialised countries. Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta and Trichostrongylus spp. are the three species responsible for the highest economic losses worldwide.

Under field conditions, most infections are usually caused by more than one species of nematodes located in the abomasum and intestine. These are generally endemic processes, with chronic course and low mortality. However, the impact of this parasitism depends on the infection intessity, as well on the physiological and immunological state of the host. Most common clinical signs include anorexia, diarrhoea, emaciation and anaemia. However, in cases of high levels of infection, especially in young animals, death can take place.

Administration of anthelmintic drugs has been the treatment of choice for the control of these parasites for many years due to the availability of highly effective and safe drugs. However, the increasing prevalence of anthelmintic resistance worldwide has led to control programmes that are costly and unsustainable in the long term. In addition, climate change is increasing the incidence and intensity of these infections, which exarcebates their economic impact on livestock farming. Therefore, searching for new drugs with anthelmintic activity and new mechanisms of action is vital.

To address this problem, the general objective of the present Thesis is focused on the search for new compounds with potential anthelmintic activity against trichostrongylid infections in sheep which could alleviate the problems arising from the the emergence of resistance.

In this context, three out of five chapters described in the present Thesis are focused on the evaluation of the possible anthelmintic activity of several families of compounds synthesized by the Department of Pharmaceutical Chemistry of the University of Salamanca. First, the compounds were subjected to a primary screening at a dose of 50 μM to determine their in vitro efficacy against different parasitic stages of the nematode T. circumcincta. Those compounds with an efficacy higher than 90% were selected to carry out studies with a triple resistant isolate (to benzimidazoles, ivermectin and levamisole), as well as to calculate their effective dose 50 (ED50).

At the same time, in vitro cytotoxicity studies were carried out to discard the most toxic compounds. Therefore, the three compounds with the highest anthelmintic activity and lowest in vitro toxicity were selected in order to study their in vivo toxicity and efficacy in gerbils and sheep. Two diamine and one benzimidazole derivatives were selected as candidate compounds, all of them with an ED50 below 3 μM in one of the tests carried out. Once the potential adverse effects of oral administration of the candidates in mice were discarded, their anthelmintic efficacy was evaluated using Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) infected with H. contortus. After observing a 95% reduction in the number of pre-adults in the stomach of the gerbils in the group treated with the benzimidazole derivative at a dose of 200 mg/kg, we decided to evaluate the efficacy of the compound in the definitive host, the sheep.

In the last experiment, the group of sheep treated with the benzimidazole derivative at a dose of 120 mg/kg produced a 99% reduction in the number of eggs in faeces 7 days after administration, and a 95% reduction in the number of adults present in the sheep abomasum. Under this context, the BZ derivative demonstrated to be an interesting candidate for the development of an anthelmintic drug. For this reason, we believe it is necessary to carry out further studies to establish a minimum effective dose, as well as to determine its efficacy in different GIN species and isolates, and to carry out detailed pharmacokinetic and pharmacodynamic studies.

In this context, during the international stay at the “Swiss Tropical and Public Health Institute”, in Basel (Switzerland), part of the compounds previously tested in the nematode T. circumcincta, were evaluated against another model of GIN infecting mice: Trichuris muris. Three compounds were selected for their potent activity against the first larvae stage in an initial screening at a dose of 100 μM, and subsequently their efficacy against the adult forms of the parasite was tested. The three candidates consisted of two benzimidazole and one aminoalcohol derivatives, being different from those selected in the previous experiment. Additionally, these candidates were tested against adult forms of Heligmosomoides polygyrus. As a final result, two of them showed efficacy, at least, against one of the two parasites; one derivative showed an ED50 of 8.1 μM against T. muris and BZ12 showed an ED50 of 5.3 μM against H. polygyrus. Therefore, both compounds could also be potential candidates for future in vivo efficacy studies using infected animals.

Another approach that we have considered in the present Thesis, in order to combat the problem of the lack of new anthelmintic drugs, is related to the search for improved screening techniques that allow the evaluation of large number of compounds in a short period of time. Thus, during the second international stay at the "Laboratory of Growth Regulators" of the University of Palacký, in Olomouc (Czech Republic), a high-throughput compound screening protocol was set up using the wMicrotracker ONE device on T. circumcincta and H. contortus. This device is able to automatically measure the mobility of the different parasite stages after their incubation with the compounds by means of infrared light microbeams.

Complementarily, we have also carried out studies to determine the level of benzimidazole resistance of gastrointestinal nematodes present in sheep flocks in Castilla y León by means of in vivo, in vitro and molecular techniques. Our study confirmed an increase in the occurrence of anthelmintic resistance compared to the last data analysed in previous years, being T. circumcincta the most resistant species.

In this study, 35% of the sampled farms were resistant to netobimin by the in vivo faecal egg reduction test and 26% by the in vitro egg hatching test, with a very high correlation between both techniques (r= -0.770; p < 0.0001). At molecular level, we also observed that a novel polymorphism at codon 198 of the isotype-1 β-tubulin gene can confer BZ resistance on its own in T. circumcincta. A very high and similar correlation was demonstrated between the presence of the new polymorphism and resistance measured by in vivo and in vitro assays (r > 0.720; p < 0.0001).