Análisis de la formación de cloroanisoles por "Trichoderma longibrachiatum": caracterización del gen codificante del enzima clorofenol o-metiltranferasa (CPOMT)

Abstract

En este trabajo se han desarrollado técnicas biotecnológicas para combatir el problema del cork taint. El cork taint, o contaminación del vino por corcho, consiste en la aparición en el tapón de una serie de metabolitos microbianos que al pasar al vino le confieren unos olores y/o sabores desagradables que arruinan sus propiedades organolépticas naturales e impiden su comercialización. En este trabajo se ha purificado por primera vez un enzima clorofenol O-metiltransferasa (CPOMT) responsable de esta metilación en el hongo filamentoso aislado del corcho Trichoderma longibrachiatum. Posteriormente se procedió a la secuenciación de péptidos internos por MALDI-TOF/TOF y ESI-IT y, a partir de la secuencia de estos péptidos, al diseño de cebadores con los que se logró clonar el gen cpomt de 1637 pb con la presencia de 4 intrones y que codificaba una proteína de 468 aminoácidos. Este gen fue silenciado mediante ARN cortos de interferencia dando lugar a una cepa que presentaba un decrecimiento del 40% en la actividad CPOMT con respecto a la cepa silvestre y una disminución en la formación de 2,4,6-TCP en medio líquido de un 53%. Así pues se confirmaba que este gen es responsable directo de la aparición de 2,4,6-TCA en el corcho y que por tanto su atenuación daba lugar a un descenso drástico en la producción de 2,4,6-TCA por el hongo. Por otra parte se abordó la expresión heteróloga del gen pel3 de Pleurotus eryngii en T. longibrachiatum. Dicho gen codifica un enzima lacasa capaz de oxidar numerosos compuestos aromáticos provenientes de la degradación de la lignina. La expresión de este gen en T. longibrachiatum (aunque lograda de manera poco eficiente) dio lugar a una cepa que al crecer sobre corcho granulado contaminado con 2,4,6-TCP producía un descenso en las concentraciones de 2,4,6-TCA y 2,4,6-TCP de entorno al 20% con respecto a los encontrados en los cultivos de la cepa silvestre. Estos valores indican que unos mayores niveles de la expresión de la actividad lacasa en T. longibrachiatum podrían dar lugar a un descenso considerable en la cantidad de 2,4,6-TCA presente en el corcho.

Por tanto estas dos técnicas se presentan como la base de una prometedora estrategia biotecnológica a desarrollar en el futuro frente al cork taint y que podría conseguir paliar las pérdidas económicas para bodegueros y fabricantes de tapones de corcho afectados por este problema