Evaluación de la liberación de endotoxinas bacterianas inducida por antibióticos utilizados en el tratamiento de mamitis en ganado bovino

Abstract

[ES] La mamitis es una de las enfermedades más comunes en el ganado lechero y causa de importantes pérdidas económicas en el sector lácteo en todo el mundo, así como de efectos negativos sobre el bienestar animal. Se caracteriza por una reacción inflamatoria de la glándula mamaria que produce cambios significativos en la composición bioquímica de la leche, estando asociada principalmente a infecciones por bacterias, tanto Gram negativas como positivas. La liberación de endotoxinas asociada a la lisis bacteriana es un factor relevante en el curso clínico de la mamitis causada por bacterias Gram negativas y debe tenerse en cuenta en el manejo clínico de estas infecciones empleando antibióticos. Es por ello que la detección de endotoxinas en muestras de leche puede ser una herramienta de gran utilidad en la gestión de la mamitis en las explotaciones lecheras. De forma similar, el estudio de la cinética de inhibición de diferentes bacterias patógenas y de la cinética de liberación de endotoxinas tras la exposición a diferentes antibióticos puede proporcionar información de interés para el manejo clínico de esta importante enfermedad. En esta Tesis Doctoral hemos optimizado un ensayo turbidimétrico cinético basado en lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para la cuantificación de endotoxinas en muestras de leche, introduciendo en el procedimiento un pretratamiento de estas muestras mediante filtración a través de un filtro de polivinilo y dilución con el fin de minimizar las interferencias asociadas a esta compleja matriz. En una segunda etapa, hemos investigado, empleando esta técnica el efecto de algunos antibióticos empleados de forma habitual en el tratamiento de mamitis sobre el crecimiento bacteriano y la liberación de endotoxinas, empleando un sistema de cultivo en leche o cultivos mini-ubre que trata de reproducir las condiciones de la infección en la glándula mamaria. La técnica de detección y cuantificación de endotoxinas optimizada fue validada siguiendo las indicaciones establecidas por las normas de la Organización Internacional de Normalización, empleándose para la determinación en muestras de leche procedentes de animales con mamitis clínica asociada a bacterias tanto Gram negativas como positivas, en muestras de leche de tanque y en leches comerciales. Nuestros resultados demuestran la robustez y utilidad de este ensayo para la cuantificación de endotoxinas en un amplio rango de concentraciones, permitiendo identificar mamitis por coliformes en muestras de leche de animales con enfermedad clínica de la glándula mamaria, así como detectar endotoxinas en muestras de leche de tanque o incluso en algunas leches comerciales UHT (tratamiento a altas temperaturas). El modelo experimental optimizado de cultivo en leche o cultivos mini-ubre permitió simular las condiciones de una infección intramamaria con dos especies de bacterias Gram negativas, previamente aisladas de leches de animales con mamitis, Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, y valorar el efecto de la exposición a cuatro antibióticos de uso habitual en el manejo de mamitis clínicas en ganado vacuno: bencilpenicilina, dihidroestreptomicina, cefalosporina y cefapirina. Se determinaron las cinéticas de inhibición de crecimiento y de liberación de endotoxinas en estos cultivos, comparándolas con las obtenidas en controles con idénticas condiciones, pero sin tratamiento antibiótico. Todos los antibióticos valorados, tal y como era de esperar, provocaron una reducción del crecimiento, más acentuado a partir de las 3-4 horas de exposición, aunque con diferencias en las cinéticas de inhibición en función del modo de acción. Además, todos los antibióticos generaron una liberación de endotoxinas en comparación con los controles que también varió en función del antibiótico. Así, la exposición a cefalosporinas se asoció a una muerte bacteriana más lenta y, al mismo tiempo, a una mayor liberación de endotoxinas, probablemente a consecuencia de fenómenos de filamentación bacteriana por cambios en la morfología de la membrana celular de las bacterias. Por el contrario, el tratamiento con dihidroestreptomicina combinó una rápida actividad bactericida con una liberación más reducida de endotoxinas, probablemente a consecuencia de una lisis celular rápida.

[EN] Mastitis is one of the most common diseases in dairy cattle and causes significant economic losses in the dairy industry worldwide, as well as negative effects on animal welfare. It is characterized by an inflammatory reaction of the mammary gland that produces significant changes in the biochemical composition of milk, being associated with infections by both Gram-negative and Gram-positive bacteria. The release of endotoxins associated with bacterial lysis is a key factor in the clinical course of mastitis caused by Gram-negative bacteria and should be taken into consideration when using antibiotics in the management of these infections. Therefore, the detection of endotoxins in milk samples would be of great interest in the management of bovine mastitis. Similarly, the study of the inhibition kinetics of different pathogenic bacteria as well as endotoxin release kinetics after exposure to different antibiotics would provide relevant information for the clinical approach of this important disease. In this PhD thesis we have optimized a kinetic turbidimetric assay based on Limulus amebocyte lysate (LAL) for the quantification of endotoxins in milk samples, introducing into the procedure a pre-treatment by filtration through a polyvinyl filter and dilution in order to minimize the interferences associated with this complex matrix. In a second stage, we have investigated, using this technique, the effect of some antibiotics commonly used in the treatment of bovine mastitis on bacterial growth and endotoxins release, using a milk culture system or mini-udder cultures which reproduce the conditions of the infection of the mammary gland. The optimized endotoxin detection and quantification assay was validated following the indications established by the standards of the International Organization for Standardization and was used for the determination in milk samples from animals with clinical mastitis associated with both Gram-negative and Gram-positive bacteria, in bulk milk and in commercial UHT (ultra high temperature) treated milk. Our results demonstrate the robustness and usefulness of this assay for the quantification of endotoxins in a wide range of concentrations, allowing the identification of coliform mastitis in milk samples from animals with clinical mammary gland disease, as well as detecting endotoxins in bulk milk or even in some commercial milks. The experimental model or mini-udder cultures allow the reenactment of the conditions of an intramammary infection with two species of Gram-negative bacteria, previously isolated from the milk of cows with mastitis, Escherichia coli and Enterobacter aerogenes, and to assess the effect of the exposition to four antibiotics commonly used in the management of clinical mastitis in cattle: benzylpenicillin, dihydrostreptomycin, cephalosporin and cephapirin. The kinetics of growth inhibition and endotoxin release were investigated in these cultures and compared with the kinetics determined in controls with identical conditions, but without antibiotic treatment. As expected, all antibiotics tested caused a significant reduction in growth, more pronounced after 3-4 hours of exposure, with differences in these inhibition kinetics depending on each antibiotic and its mode of action. Furthermore, all antibiotics produced a release of endotoxins compared to the controls which also varied depending on the antibiotic. Thus, exposure to cephalosporins was associated with a slower bacterial death and, at the same time, a greater release of endotoxins, probably as a result of bacterial filamentation phenomena due to changes in the morphology of the bacterial cell membrane. In contrast, dihydrostreptomycin combined a quick bactericidal activity with a reduced release of endotoxin, probably as a result of rapid cell lysis.